pcr法检测初发aml患者flt3基因itd突变和d835点突变与其临床意义

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1、●减少对支持治疗的依赖，且无明显不良反应【140”。此外FLT3为分子伴侣HSP90的客户蛋白，HSP90与FLT3形成复合物，通过ATP供能，维持FUl3成熟、稳定、有功能的构型。HSP90抑制剂直接与HSP90的ATP结合部位结合，抑制了HSP90作为分子伴侣的功能，导致FLT3多聚泛蛋白化，然后转运入蛋白体被降解【18】。因此HSP90抑制剂HA和17．AAG目前也正在进行各方面实验室研究【19,20]。本文对近一年束我院初发的AML进行FLT3／ITD突变及D835点突变检测，并结合患者临床资料分析FLT3／ITD突变及D835点突变的l临床意义。6●材料与方法1患者

2、：患者为05年6月～06年3月我院血液科根据MIC标准诊断的初发AML患者。其中男性12例，女性13例，年龄23～77岁，平均年龄51．36岁。详细基本情况见表1。另有5名正常献血员为正常对照。表1患者基本情况2DNA抽提及单个核细胞分离保存：2．1试剂及仪器：血液基因组DNA小量抽提试剂盒(SKl261)购自上海生工生物工程技术服务有限公司。Ficoll液、新生小牛血清购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。●■RPMI一1640粉剂(GIBCO公司生产)加三蒸水1000ml充分溶解，磁力搅拌器搅拌，调整pH为7．2—7．4，0．22um微滤膜过滤除菌，分装后--20℃保存。

3、红细胞裂解液制备：称取KHC031．09，NH。C18．39，EDTA—Na：37mg，用三蒸水1000ml充分溶解，搅拌，O．22lam微孔滤膜过滤除菌，分装后4℃保存。冻存液制备：取一无菌试管，加入PRMI一1640培养液、40％血清，逐滴加入二甲基亚砜(DMSO)至2096浓度，即制成双倍的冻存液。(每次冻存前制备)低分子肝素钠、二甲基Ⅱ砜、无水乙醇(DNA抽提时使用)为常规实验室配置。80—2型离心沉淀机为上海手术器械厂产品，sw—cJ一1F超净工作台为苏州安泰空气技术有限公司产品，2．2DNA抽提：抽取患者骨髓液或外周血3．5ml，肝素抗凝，取其中0．5ml按DNA

4、抽提试剂盒说明加入800pi的TBPBuffer，轻轻吹打使其彻底混匀，4000rpm离心3分钟，弃上清。重复一至两次，至沉淀为无色或淡红色后用200蛆TE悬浮。加入500蛆TBMBuffer，混匀，再加入4肛1ProteinaseK，混匀，55℃保温10’20分钟。加入260pI无水乙醇，混匀，然后将样品转移到套放于2一mlCollectionTube的UNIO-10柱中。8000rpm室温离心1分钟。取下UNIO-10柱，弃去CollectionTube中的废液。将柱子放回同一根CollectionTube中，加入500NWashSolution，10000rpm室温离心

5、1分钟。重复洗涤一次。取下UNIQ-10柱，弃去CollectionTube中的全部废液。将柱子放回同一根CollectionTube中，10000rpm室温离心15秒，以除去残留的WashSolution。将UNIQ-i0柱放入新的无菌的1．5ml离心管中，在柱膜中央加入40肛lElutionBuffer，37—55℃保温2分钟。10000rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为基因组DNA。用分光光度计测取浓度，调整DNA浓度至500～600ug／ml，--20℃保存。2．3单个核细胞分离保存：加Ficoll液3ml到灭菌离心管内，然后吸取剩余3ml样品沿管壁轻轻加入到F

6、icoll液表面，避免两者混合。以2000rpm离心10分钟。吸取中间层细胞悬液，加lOml红细胞裂解液，以4000rpm离心lO分钟。移去上清，如此重复2次，以去除混入的红细胞。加PRMI一16403ml悬起细胞，取0．1mL悬液，稀释后计数，四大格中细胞数／4×104X稀释倍数，即平均每毫升细胞数。调整原细胞悬液细胞浓度至1-2×107／ml，取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液。将悬液加入灭菌冻存管中，1．5ml／支，严密封口后，立即置4℃冰箱中，30分钟后转入一20℃冰箱中，4—6小时后，转入液氮中保存，备以后使用。●3PCR扩

7、增：3．1引物：参照文科211分别设计引物1lF和12R用于FLT3／ITD突变检测，17F和17R用于D835点突变检测，引物由美国明尼苏达州癌症研究中心提供。引物序列如下：11F：5’一GCAATTTAGGTATG从AGCCAGC一3’。12R：5’-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC一3’。17F：57一CCGCCAGGAACGTGCTTG一3’。17R：5’-CAGCCTCACATTGCCCC-37。3．1试剂及仪器：TaqDNA聚合酶、PCRBuffer、MgCI。、dNTP均购自