抑癌基因tip30启动子甲基化与大肠癌侵袭和转移的关系

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1、爸_；毫：‘i原创性声明IIIIIIllIIIIIflIIIllfillf{Y1835472本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；

2、本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日期：年月日摘要摘要背景：大肠癌是世界范围内最常见的消化系统恶性肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤的第3位，严重威胁人类的健康。在我国，大肠癌死亡率已位居恶性肿瘤的第4．5位之间，并呈现增加的趋势。近年来，尽管诊治水平不断提高，但大肠癌总体疗效并无明显改善，术后5年生存率仍徘徊在30％～50％。究其原因，目前在大肠癌早期诊

3、断、预后评估、复发转移防治等方面仍然存在困难。特别是术后转移的发生，已成为患者治疗失败与死亡的重要原因。因此，深入研究大肠癌发病机制，寻找理想的用于早期诊断或预后判断的肿瘤标志物，阐明大肠癌转移分子机制，具有重要的临床意义。研究表明，肿瘤发生是经典遗传学改变与表观遗传异常共同作用的结果。DNA甲基化是表观遗传学中非常重要的基因调控机制，基因广泛低甲基化和区域性高甲基化与大肠癌发生发展密切相关。TIP30是近年新发现的一种与肿瘤转移抑制相关的基因，序列分析显示其与CC3结构相同为同一基因。TIP30在人类的正常组织如心、脑、肾、胰腺等均有表达，而在人类肝癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌中

4、的表达是下调或缺失的。研究表明，TIP30可促进细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成，可调节转移相关基因的表达，抑制肿瘤转移。最近，TIP30低表达在大肠癌组织中也得到了验证。但是，TIP30在大肠癌中低表达的原因及其分子调控机制尚未见报道。目的：(1)研究TIP30在大肠癌与配对正常大肠黏膜中的表达差异，以及TIP30基因启动乇甲基化在不同组织中的表达状态，分析TIP30启动子甲基化状态与TIP30蛋白表达、TIP30启动子甲基化状态与患者临床病理特征间的关系。(2)研究大肠癌细胞株中TIP30基因启动子甲基化状态和TIP30mRNA和蛋白表达水I摘要平，进一步探讨启动子甲基化对TIP3

5、0mRNA和蛋白表达的影响。(3)研究重建TIP30表达对大肠癌细胞体外、体内生物学特性的影响，探讨TIP30用于大肠癌基因治疗的可能性。方法：1．采用甲基化特异性PCR(MsP)、甲基化测序PCR(BSP)方法检测50例大肠癌和配对正常大肠黏膜组织中TIP30基因启动子甲基化状态，采用免疫组化法检测TIP30蛋白表达水平。分析大肠癌标本中TIP30基因启动子甲基化与TIP30蛋白表达水平是否存在相关性；分析TIP30基因启动子甲基化状态与患者临床病理特征(包括患者性别、病变部位、临床分期、血清CEA水平、淋巴结转移等)的相关性。2．采用BSP、MSP方法检测大肠癌细胞株(HCT

6、I16和HT29)中TIP30基因启动子甲基化状态，采用RT-PCR法、Westernblot法检测大肠癌细胞株中TIP30mRNA和蛋白表达水平。观察加入去甲基化药物5一aza-2’一deoxycytidine(DAC)后，存在TIP30基因启动子高甲基化的大肠癌细胞株TIP30mRNA和蛋白表达是否上调。分析TIP30表达变化与TIP30基因启动子甲基化状态的关系。3．PCR克隆人TIP30基因，连接到pMDl8．T-simple质粒上，转化大肠杆菌DH5Q，经Amp抗性、质粒DNA抽提、酶切鉴定筛选得到阳性克隆，测序。用EcoRI和BamHI限制性核酸内切酶切割测序正确的质

7、粒pMDl8．T-simple．TIP30与pCMV4一flag，所得产物连接形成真核表达载体pCMV4一flag-TIP30。用脂质体介导转染法，将构建的真核表达载体pCMV4-flag-TIP30导入培养的TIP30表达缺失的HCTIl6中，同时转染空质粒pCMV4．flag作对照。经G418筛选，获得阳性克隆细胞。用RT-PCR和Westernblot方法，检测转染真核表达载体细胞(HCTll6-TIP30)、转染空载体细胞(HCTll6．contr01)和亲本细胞(HCT