人组织激肽释放酶6原核表达载体的构建与抗体制备

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1、人组织激肽释放酶6原核表达载体的构建及抗体制备研究生：张华专业：免疫学导师：胡成进教授中文摘要目的人组织型激肽释放酶基因家族(Kallikreins，KLKs)是近年来新发现的肿瘤标志家族，属于丝氨酸蛋白酶家族，KLK6(Kallikrein6，KLK6)是该家族成员之一，编码人组织型激肽释放酶6(humanKallikrein6，hK6)。成熟的hK6蛋白含223个氨基酸，具有胰蛋白酶样活性，与乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肠癌、中枢神经系统疾病密切相关。其研究目的在于构建hK6原核表达载体并制备高效价、高特异

2、度的多克隆抗体和单克隆抗体，为建立检测方法检测组织和体液中hK6奠定基础。方法1、提取人乳腺浸润导管癌组织中总RNA，反转录为cDNA，根据GeneBank发表的核苷酸序列D78203，设计KLK6引物，扩增出KLK6基因片段，先克隆入pMD．19T克隆载体SacI、XhoI位点，经菌落PCR、双酶切鉴定和基因测序后确定pMD．19T-KLK6的重组阳性菌，然后提取质粒，胶回收纯化KLK6目的片段，克隆入pET-28b原核表达载体的多克隆位点，转化大肠杆菌BL21，筛选出阳性菌落后，IPTG诱导表达hK6

3、融合蛋白，对诱导时间、温度进行优化并确定蛋白表达形式，扩大培养，大量表达蛋白，进行镍柱纯化、SDS—PAGE及western．blot检测。2、纯化hK6融合蛋白与弗氏佐剂等体积混合，乳化均匀后，免疫新西兰大白兔和BALB／c小鼠，每10天加强免疫一次，四次免疫后抗体效价达峰值，对新西兰大白兔进行心脏采血，分离出血清，．80℃冰箱保存备用。BALB／e小鼠抗体效价达到105后，腹腔加强免疫一次，3天后取小鼠脾脏，制各脾细胞悬液，与预先培养并经8-AG筛选的骨髓瘤细胞SP2／0融合，HAT培养基选择培养，有

4、限稀释法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水获得单克隆抗体。间接ELISA方法检测抗体效价，纯化抗体后检测IgG亚型并进行westem-blot检测和免疫组化检测，抗体纯化后保存于．80℃冰箱备用。结果1、成功构建pET-28b—KLK6原核表达载体，28"(2、lmMIPTG诱导8小时时蛋白表达达峰值，且以可溶性形式表达，其hK6融合蛋白分子量为25KD。2、镍柱纯化的b_K6融合蛋白免疫新西兰大白兔和BALB／c小鼠，得到的抗血清效价为107：细胞融合后经有限稀释法筛选出4株分泌抗体的杂交瘤细胞株

5、(DB2C4、DB3D7、BD3G7、DD385)，回输小鼠腹腔，从腹水中提取单克隆抗体，效价均为51200；IgG亚型分析均为IgGl；western-blot表明，多抗和单抗都能与hK6融合蛋白特异性结合，免疫组织化学分析表明，hK6定位于细胞胞浆，在胃癌、乳腺癌、正常卵巢组织中均有表达。结论本课题成功构建了hK6的原核表达载体，通过诱导表达产物制备出高效价、高特异性的抗hK6的多克隆抗体与单克隆抗体，为深入研究hK6功能，及建立高特异性、高敏感性的检测方法，检测组织和体液中的hK6奠定基础。关键词：

6、人组织激肽释放酶；hK6；原核表达；多克隆抗体；单克隆抗体2CoNSTRUCTIoNoFTHEPRoK：ARYoTICEXPRESSIONVECTERoFHUM渔NKALLIKREIN6ANDPREP剐RAl’IoNoFIT’SANTIBoDIESPostgraduate：ZhangHuaSpeciality：ImmunologyTutor：Prof．HuChengjinABSTRACTobjectiveThekallikreingenefamily(KLKs)isonelatelydiscoveredt

7、umor-markerfamily,belongtothesecretedserineproteasefamilies．Thehumankallikreingene6(KLK6)，whichencodesforhumankallikrein6protein(hK6)，isonememberofthegcnefamily．ThematurehK6consistsof223aminoacidswitlltrypsin-likeactivity．ThereisacloserelationshipbeweenhK

8、6andbreastcancer,ovariancancer,stomachcancer,coloncancer,centralnervoussystemdiseases．TheresearchistoconstructtheprokaryotieexpressionvectorpET-28b—KLK6andpreparatepolyclonalantibodyandmonoelonalantibodywhichshowhig