伊班膦酸钠对小细胞肺癌溶骨性骨转移瘤细胞增殖抑制与凋亡的影响

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2、进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。～哆P躲．；篓h中文摘要伊班膦酸钠对小细胞肺癌溶骨性骨转移瘤细胞增殖抑制及凋亡的影响摘要目的：应用体外培养的转移性小细胞肺癌细胞，观察骨吸收抑制剂(伊班膦酸钠)对细胞增殖和凋亡的影响，为临床应用骨吸收抑制剂治疗溶骨性骨转移瘤提供新的思路和依据。方法：l肿瘤组织的取材临床中选择肺癌溶骨性骨转移的患者，共计6例，其中取自股骨转子问转移灶4例，椎体转

3、移灶2例。术前未经任何治疗(主要指放、化疗等抗肿瘤治疗)，于术中无菌条件下切取转移灶实体肿瘤组织块，立即浸入无血清培养液保鲜，并迅速进行细胞培养。将获得的组织材料在无菌条件下剪切成约1．-,2ram3小组织块，用O．25％胰蛋白酶消化液在4℃环境下进行冷消化12---24小时，离心后去除上清液，再次加入0．25％胰蛋白酶消化液，置37℃温箱中温热消化20"--30分钟，将得到的组织与细胞悬液通过100目孔径的不锈钢滤网滤过，离心后去除胰蛋白酶并用细胞培养液漂洗l～2次，然后离心去上清，制备成最终的细胞悬液。

4、2细胞培养、筛选及纯化’将最终制备的细胞悬液按5×105～1X106个／ml细胞计数接种于25ml细胞培养瓶中，加入pH值为7．O～7．2的RPMI1640培养液4ml(内含终浓度为100U／ml青霉素和10099／ml链霉素)置于37℃、5％C02、饱和湿度的恒温培养箱进行培养，约2---4天细胞开始贴壁生长后，依据不同细胞对胰蛋白酶消化液的中文摘要不同耐受时间以及差异离心的方法将原代培养的混杂生长细胞进行分离、纯化，去除成纤维细胞等杂质细胞，获得所需的肿瘤细胞蚤3实验分组将处于对数生长耢的骨转移癯细胞按

5、l×104个／fro的浓度接种到96孔细胞培养板上于培养箱内培养，待细胞贴壁生长完全覆盖孔底后，设为试验组和对照组蘸组，对照组加入同等质量分数盼0。辨越捌，试验组加入不同浓度(2、4、8}Ig／rm)的伊班膦酸钠。4细胞形态学观察倒置相差显微镜观察不同浓度和庸戴不同作用时阆细胞形态学上的差异尊5观察细胞对簧磨片的作黑将预先制备厚约50,-、一100w'n、面积约4x4mm2大小的骨磨片与空自组和对照组的肿瘤细胞共同培养，于7、量O天后，倒置相差显微镜观察不固浓度和／或不露作用时闽骨磨片吸收陷窝数目及形态学的

6、差异。6细胞增殖抑制试验采用MTT法检测伊班膦酸钠对溶骨性骨转移癯纲胞增殖翥l制情况，并测定期吸光度(OD)值，从丽计算细胞增殖抑制率=<1．A试验组／A对照组)x100％。7测定细胞生长曲线按1×104个／魏的浓度将单细胞悬液接种子篼孔培养板中，按照实验分组分别计入0．9％NaC[和不同浓度的伊班膦酸钠溶液，每组设3个复孔，每24小时取3孔进行消化计数，连续7天，绘制细胞生长曲线。S流式细脆术分析瘟焉美国B。D公霹的FACS-420流式细胞仪检测经不同浓度伊班膦酸钠溶液作用48小时后肿瘤细胞凋亡、细胞周期

7、，以及细胞凋亡相关基因be卜2与bax的表达幸结果：1细胞形态学观察倒置相差显微镜下观察，可见空自组细胞生长良好，细胞密度较大，相互连接，星梭形或不规爨l』多边形。细胞透明度大、折光性强、轮廓不清e高2中文摘要倍镜下可部分细胞细微结构，细胞核隐约可见，胞浆内颗粒含量少。实验组细胞数明显减少，细胞折光性减弱，轮廓增强，胞浆内出现空泡，脂瀛等颗粒样物质。细胞失去原有形态，贴壁性减弱，培养液中漂浮细胞数目和崩解的细胞碎片明显增多，且有明显时间及浓度梯度依赖。2观察细胞对骨磨片盼作用倒置相差显微镜下可见空自组中的骨

8、磨片吸收陷窝较多、较深，相互连接成片，呈现梅花状、串珠状，而试验组骨磨片骨吸收陷窝形成减慢，数量减少，陷窝多呈单个圆形，难以连接成片，同样存在时间和浓度梯度依赖性。3细胞增值抑制试验采用MTT法测定细胞增殖抑制率，显示在初始接种等量细胞数目的前提下，空白组MTT结晶物多于各试验组，测定其吸光度(OD)值高于试验组，焉试验组则呈现随浓度梯度逐渐下降的趋势，其细胞增殖抑制率逐渐增高。4测定细胞生长蓝线根据细胞计数结果