奶牛子宫内膜抗菌肽分离纯化、bnbd5基因的克隆及原核表达

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1、甘肃农业大学2009届博士学位论文摘要内源性抗微生物肽是生物体内先天性免疫的重要组成部分，防御素是广泛分布于动物和植物界的一类富含半胱氨酸的阳离子内源性抗微生物肽，是内源性抗微生物肽中的一个大家族。是由生物细胞特定基因编码，经特定外界条件诱导产生的一类多肽。具有抵抗外界微生物侵害、消除体内突变细胞的作用。根据防御素分子内半胱氨酸的位置和连接方式、前体性质及表达位置的差异可分为Q一防御素、B一防御素、o一防御素、昆虫防御素和植物防御素五种类型，防御素主要分布于哺乳动物的黏膜上皮细胞内，所以，防御素被确认为黏膜表面抗微生物屏障的组成成分。在实验中以奶牛子宫为实验材料，从奶牛子宫内膜上皮

2、组织中提取总RNA，根据已发表的牛抗菌肽基因序列设计引物。经RT-PCR扩增抗菌肽DNA片段，回收纯化PCR产物，连接pMDl8．T载体，转化感受态细胞DH5。。在含X．Gal、Amp及IPTG的LB平板上筛选阳性克隆，经PCR及双酶切鉴定后，对目的片段进行测序。结果表明，RT-PCR扩增出的eDNA片段碱基数为138bp，编码45个氨基酸的多肽，多肽中含6个保守半胱氨酸残基。用Blast程序进行检索比较，表明扩增序列与GenBank中发表的BNBD5编码区序列99．3％相同。利用DNAStarMegAlign分析了奶牛子宫内膜抗菌肽BNBD5与其他物种13，防御素5的ORF序列，

3、得出奶牛BNBD5的eDNA与其他动物的B．防御素5的同源性。与山羊(Caprahireus，DQ532360)有80．4％的同源性，与小鼠(MusmusculUS，NM030734)有56．5％的同源性，与褐鼠(Rattusnorvegieus，NM_001037549)有31．9％的同源性，而与冈比亚按蚊(Anophelesgambiae，EU273600)、中华蜜蜂(Apiseeranaccrana，EU727272)和原鸡(Gallusgallus，AY621320、AY621307、DQ677636)的同源性均低于20％。这说明反刍动物的B防御素eDNA具有种属特异性。再

4、以重组质粒为模板，用特异性表达引物扩增得到的基因：即编码BNBD5基因全长eDNA连接到原核表达载体pET28a中，构建的原核表达质粒pET-BNBD5，转化大肠杆菌BL21(DE3)。结果表明：成功构建了pET28a-BNBD5载体，经IPTG的诱导，pET28a-BNBD5在原核内表达产物相对分子质量约为10妣与预期融合蛋白大小一致，并以包涵体的形式存在，琼脂扩散实验检测表达产物的体外抑菌活性，在甘肃农业大学2009届博士学位论文大肠杆菌中表达的奶牛子宫内膜抗菌肽的体外抑菌活性不太明显。本实验再以奶牛子宫为实验材料，刮取内膜上皮，用5％的冰乙酸抽提，通过酸性尿素聚丙烯酰胺电泳洗

5、脱技术和反相高效液相色谱技术，分离纯化奶牛子宫黏液内源性抗菌肽，并进行其抗菌活性的检测。活性检测结果表明：在5min收集的样品没有抑菌圈出现，在45min收集的样品具有抗大肠杆菌BL21和金黄色葡萄球菌26003的活性。奶牛子宫内膜防御素的发现有利于对奶牛黏膜的防御机制进行进一步的研究，从而为奶牛子宫内膜炎防治奠定了基础。关键词：奶牛；子宫内膜抗菌肽；分离纯化；原核表达：生物活性Ⅱ甘肃农业大学2009届博士学位论文晕毫暑喜舞毫皇昌曼葛詈暑詈皇皇鼍晕鼍詈皇暑皇皇皇詈葛量鼍詈喜皇毫皇毫喜皇■鼍E量量曼曼詈昌詈—■

6、—詈昌詈皇!曼量置—置皇皇皇I一。-I鼍Summary，．Endogen

7、ousantimicrobialpeptidesareanimportantcomponentininnateimmunityoforganismdefensinsareakindofpositiveEndogenousantimicrobialpeptides，whichcontaincysteine—richanddistributeabroadinkingdomofanimalsandplants．Defensinsarealargefamilyamongcationicendogenousantimicrobialpeptide．Asakindofpolypeptide，c

8、ontrolledbyspecificgeniecodeandinducedunderspecificexternalconditions．EndogenousantimicrobialpeptidesCanresisttheinvasionofoutsidemicroorganismandkillinnermutantcells．Accordingtothedifferencesofpositionandconnectlllannerofcysteines，thep