gb-t 16347-1996 乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验

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1、中华人民共和国国家标准GB/T16347-1996乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验Microbiologicalexaminationoflacticacidbacteriainyoghurtbeverage 1主题内容与适用范围本标准规定了乳酸菌饮料中乳酸菌检验的技术要求。本标准适用于以鲜乳、乳粉或辅以大豆等为原料，经乳酸菌发酵加工制成的具有相应风味的活性乳酸菌饮料。 2引用标准GB4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 3术语乳酸菌：一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。乳酸菌菌

2、落总数：检样在一定条件下培养后，所得1mL检样中所含乳酸菌菌落的总数。 4设备和材料4.1温箱：36±1℃。4.2冰箱：0~4℃。4.3恒温水浴：46±1℃。4.4电炉：可调式。4.5吸管：容量为1，10和25mL。4.6广口瓶或三角瓶：容量为500mL。4.7平皿：直径为9cm。4.8试管：18×180mm。4.9显微镜。 5培养基和试剂5.1改良TJA培养基（改良番茄汁琼脂培养基）。5.2改良MC培养基（ModifiedChalmers培养基）5.30.1%美兰牛乳培养基。5.46.5%氯化钠肉汤。5.5pH9.6葡萄糖肉汤。5.640%胆汁肉汤。5.7淀粉水解

3、培养基。5.8精氨酸水解培养基。5.9乳酸杆菌糖发酵管。5.10七叶苷培养基。5.11革兰氏染色液：按GB4789.28规定执行。5.123%过氧化氢溶液：按GB4789.28规定执行。5.13蛋白胨水、靛基质试剂：按GB4789.28规定执行。5.14明胶培养基：按GB4789.28规定执行。5.15硝酸盐培养基、硝酸盐试剂：按GB4789.28规定执行。5.16生理盐水：定量分装于三角瓶和试剂管内灭菌。 6乳酸菌菌落总数的测定6.1检验程序乳酸菌菌落总数检验程序如下：检样作成几个适当倍数的稀释液选择2~3个适当稀释度，各以1mL之量加入灭菌平皿内每皿内加入适量改

4、良TJA或改良MC培养基             36±1℃72±3h菌落计数报告      6.2操作步骤6.2.1以无菌操作将经过充分摇匀的检样25mL（或25g）放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成1:10的均匀稀释液。6.2.2用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。6.2.3另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL灭菌吸管。6.2.4选择2~3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1

5、mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。6.2.5稀释液移入平皿后，应及时将冷至50℃的乳酸菌计数培养基（改良TJA或改良MC）注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1mL稀释液检样用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束须在20min内完成。6.2.6待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养72±3h取出，观察乳酸菌菌落特征（见表1），选取菌落数在30~300之间的平板进行计数。计算后，随机挑取52上菌落数进行革兰氏染色，显微镜检查并做过氧化氢酶试验。划兰氏阳性，过氧化氢酶阴

6、性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌。根据证实为乳酸菌菌少计算出该皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。例如，检样10-4的稀释液在改良TJA琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取5个鉴定，证实为乳酸菌的是4个，则1mL检样中乳酸菌数为：6.3乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生产形态特征见表1。表1乳酸菌在不同培养基上菌落特征 改良TJA改良MC杆菌平皿底为黄色，菌落中等大小，微白色，湿润，边缘不整齐，直径3±1mm，如棉絮团状菌落平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，边缘似星状，直径2±1mm，可有淡淡的晕球菌平皿底为黄色，菌落光滑，湿润

7、，微白色，边缘整齐平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，边缘整齐，可有淡淡的晕注：干酪乳杆菌在改良TJA培养基上为圆形光滑，边缘整齐，侧面呈菱形状。 7乳酸菌的鉴定对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定时，则作以下试验。7.1菌种制备：自平板上未免取菌落，接种于改良TJA或改良MC琼脂斜面，于36±1℃，24~48h培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。7.2乳酸杆菌鉴定试验：极少见还原硝酸盐，不液化明胶，不产生靛基质和硫化氢。7.3常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应，见表2。7.4产乳酸的链球菌的鉴别试验，见表3。表2常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应 七叶苷纤维二糖麦芽