凉膈散经胆碱能信号通路拮抗lps致raw264.7细胞损伤机制研究

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1、硕士学位论文法检测细胞炎症因子IL．6和TNF．u的表达。3．蛋白印迹法检测凉膈散对NF．vd3信号通路的影响采用蛋白印迹法(Westemblotting)检测非毒剂量凉膈散(25，50，100，200，400rtg／m1)对LPS(1gg／mL)刺激RAW264．7细胞所致NF-v,B信号通路关键蛋白Ir,Bn的降解及其磷酸化的影响；采用荧光共聚焦显微镜观察NF-vd3p65在细胞中的表达，Westernblotting和凝胶迁移电泳(EMSA)法检测凉膈散(400gg／m1)对LPS诱导RAW264．7细胞NF．vd3p65入核的影响。4．胆碱能抗炎通路关键蛋白a7nAchR受到抑制后

2、凉膈散对炎症因子及NF-v,B信号通路的影响运用a7nAchR特异性siRNA和特异性抑制剂甲基牛扁碱(methyllycaconitine，MLA)作用RAW264．7细胞后，采用WesternBlotting检测非毒剂量下不同浓度的凉膈散(25，50，100，200，400gg／m1)对LPS刺激RAW264．7细胞所致炎症中，胆碱能抗炎通路关键蛋白a7nAchR表达水平的变化。用Lipofectamine3000转染siRNAa7nAchR使et7nAchR蛋白基因沉默或用a7nAchR特异性抑制剂甲基牛扁碱预处理细胞2小时抑制a7nAchR蛋白后，给予凉膈散(400gg／mI)，采

3、用WesternBlotting检测凉膈散对LPS刺激RAW264．7细胞所致炎症模型总蛋白中NF．rd3信号通路关键蛋白Ir,Ba的降解及其磷酸化蛋白，核蛋白中NF．r,Bp65表达水平的变化；采用ELISA法检测a7nAchR被特异性抑制(siRNAa7nAchR、甲基牛扁碱)后，凉膈散(400gg／m1)对LPS诱导产生的细胞炎症因子IL．6和TNF．c【表达水平的影响。结果1．凉膈散在25～400gg／ml浓度下对RAW264．7细胞无明显细胞毒性作用细胞毒性实验(MTT)结果显示，与空白组相比较，25，50，100，200，400gg／ml的凉膈散作用RAW264．7细胞24小时

4、后，基本没有毒性(存活率>85％)，而800I，tg／ml的凉膈散对RAW264．7细胞有一定毒性作用(存活率<85％)。因此，选择凉膈散作用于RAW264．7细胞的非毒剂量浓度为25，50，100，200，400gg／ml。TTT万方数据摘要为进一步验证凉膈散与LPS共同作用细胞时对细胞的毒性，我们将不同浓度的凉膈散(25，50，100，200，400pg／mI)与LPS(1pg／m1)共同培养细胞24小时。实验结果表明凉膈散(25～400I．tg／m1)与LPS(1pg／m1)共同作用于细胞24小时，对细胞基本没有毒性(存活率>85％)。2．凉膈散抑制LPS诱导RAW264．7细胞炎症

5、因子的产生ELISA法实验结果显示，用非毒剂量的凉膈散(25，50，100，200，400PgJ7m1)作用RAW264．7细胞24小时，与空白组相比较，凉膈散对细胞IL．6和TNF．伐的产生基本没有影响。进一步用非毒剂量的凉膈散和LPS(1lag／m1)共同作用RAW264。7细胞24小时，结果发现凉膈散可以显著抑制LPS诱导RAW264．7细胞产生的炎症因子IL．6和TNF．Ⅱ的表达。3。凉膈散经由NF．r．B信号通路抑制LPS诱导RAW264．7细胞产生的炎症Westernblotting对细胞总蛋白检测结果显示，与空白组对比，1}tg／ml的LPS刺激RAW264．7细胞后，NF．

6、rd3信号通路关键蛋白Ird3a发生降解，其磷酸化蛋白P．Ird3cL表达增加。用非毒剂量的凉膈散(25，50，100，200，400ktg／m1)处理RAW264．7细胞24小时后，可以有效抑制LPS刺激导致Iv,Ba的降解和磷酸化。共聚焦荧光显微镜观察发现，在空白对照组中，NF．vd3p65主要存在于RAW264．7细胞的细胞质中，而在细胞核中基本不表达；采用LPS刺激后，细胞核中的NF．rd3p65表达量明显增加，表明LPS刺激NF。rd3p65从细胞质向细胞核转移；用浓度为4001．tg／ml的凉膈散预处理细胞24小时可以显著抑制LPS诱导的NF．rd3p65核转位；Westemb

7、lotting及EMSA检测细胞核蛋白中NF．rd3p65的表达实验也验证了凉膈散能有效抑制LPS诱导的NF．rd3p65核转位。这些结果表明凉膈散经由NF．1cB信号通路抑制LPS诱导RAW264．7细胞产生的炎症。4．凉膈散经由胆碱能抗炎信号通路抑制NF．r,B信号通路进而抑制LPS诱导产生的炎症Westernblotting检测细胞总蛋白结果显示：非毒剂量的凉膈散(25，50，100，200，400¨g／m1)可以