蛋白中rgd结构域对其生物学活性的影响及p48.2蛋白多克隆抗体的制备

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1、北京协和医学院硕士学位论文中英文缩略语表ABTS2,2'-azino-di(3-ethylbenzothiazoline2,2’．联氮一双(3．乙基苯sulfonate)并噻唑啉磺酸)AmpAmpicillin氨苄青霉素bpBasepair碱基对CDKCyclin-dependentkinase周期蛋白依赖性激酶CDSCodingsequence编码区DABDiaminobenzidine3，3一四盐酸二氨基联苯胺DAPI2·(4-Amidinophenyl)一6一indolecarbamidine联

2、眯基苯吲哚酸盐dihydrochlorideDMSOdimethylsulfoxide二甲基亚砜EDl’AEthyenediaminetetraceticacid乙二胺四乙酸ELlSAenzyme—linkedimmunosorbentassay酶链免疫吸附实验FITCfluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素Fn3Fibronectintype-III纤层蛋白Ill型GFPgreenfluorescentprotein,绿色荧光蛋白GSTGlutathione．S．Trans；

3、ferase谷胱甘肽硫转移酶Hl冲horse-radishperoxidase辣根过氧化物酶lPTGIsopropylthio-p-Dgalactoside异丙基-p-D一硫化半乳糖苷l①Kilodalton千道尔顿LBLuriaBrothLB细菌培养基MEMModifiedeaglemediumMEM培养基ODopticaldensity光密度PIAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSPhosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液

4、PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应5北京协和医学院硕士学位论文PIPropidiumiodide碘化丙啶PMSFphenylmethysulfonyfluoride苯甲基磺酸钠RGDArg-·Gly·-Asp精氨酸残基．甘氨酸残基．天氨酸残基IU’-PCRReversetranscription-polymerasechain反转录聚合酶链反应reactionSDSsodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠TEMEDN，N，N’，N'-tetramethyle

5、thylendiamineN，N，N’，N’，一四甲基乙二胺三羟甲基氨X．Gal5-bromo-4-chloro··3-·indolyl-·13··D5一溴．4．氯．3-吲哚一p—D一galactoside半乳糖苷6北京协和医学院硕士学位论文中文摘要p48．2蛋白是一个具有I类细胞因子受体保守功能域的免疫新分子。本实验室从K562细胞中克隆出p48．2，并提交NCBIGenBank(DQ298450)。p48．2基因定位在17q11．2，邻近NFl基因，在神经纤维瘤患者中，p48．2基因常与NFI基因

6、一起缺失。p48．2基因编码区全长1317bp，编码一个438个氨基酸的蛋白质。在以往的研究中发现，p48．2在细胞中的过表达可以使细胞周期停滞在G0／G1期。我们预测它是一种细胞周期负性调节因子，并进一步探讨了其分子机制。生物信息分析显示：p48．2基因进化高度保守，多种生物体内均有其同源蛋白。它不具有跨膜结构域，也没有核定位信号和细胞器定位信号，是一种胞浆可溶性蛋白质。对p48．2结构域分析显示：p48．2蛋白具有一个Fn3功能域，该功能域内部靠近C．末端，有一个RGD序列和I类细胞因子受体特有的

7、WSXWS基序。RGD序列是整合素和其配体相互作用的识别位点，介导细胞与细胞外基质及细胞问的粘附作用，同时具有信号传导功能。本课题的一部分工作是探讨p48．2蛋白中RGD结构域对其生物学活性的影响，具体研究如下：1)利用PCR定点突变技术构建了RGD'-"RGE和RGD缺失的重组真核表达质粒pCMV-RGE和pCMV-DEL。2)将pCMV-p48．2和两种突变质粒转染293T细胞，免疫荧光染色检测到p48．2及突变体均定位在细胞浆，充分表达后有向胞膜运动的趋势，RGD序列缺失后未影响p48．2蛋白的

8、定位。3)将p48．2基因和两种突变基因亚克隆入pEGFP-N1，利用GFP／DNA双标记流式细胞技术检测细胞周期，p48．2及其突变体均可诱导293T细胞G0／G1期停滞，S期减少。4)将pCMV-p48．2和两种突变质粒转染293T细胞，RT-PCR检测他们均能下调周期蛋白D1、D2的表达。上述结果提示p48．2蛋白是一种胞浆蛋白，它在293T细胞中过量表达可以下调周期蛋白Dl、D2的表达，使细胞周期停滞在G0／G1。RGD结构域未参与p48．2蛋白