基于二氢叶酸合成酶的磺胺类药物多残留快速检测分析研究

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1、基于二氢叶酸合成酶的磺胺类药物多残留快速检测分析研究-->第一章引言1.1研究目的和意义抗菌药物是兽医临床治疗及作为促生长词料添加剂而应用最为遍及的一类药物。动物源食品中抗菌药物残留超标，不但直接威胁人类康健和生命宁静，同时诱导动物食源细菌孕育发生耐药性，通过耐药基因通报到人类致病菌，低落抗菌药物疗效，严峻危害人类康健和生态情况[1，2]。为了进步大众康健程度，天下列国纷纷订定相干尺度和法例，限定乃至克制某些抗菌药物的利用和在动物源食品中的残留。对付某些可以利用的抗菌药物，也严酷划定了其利用范畴、最高残留限量和休药期等尺度。除了从源头上控制抗菌药物的不公道利用乃至滥用，实时、正

2、确的检测动物源食品中药物残留是保障宁静的紧张的关键。因此，创建轻便、快速、敏捷、广谱的残留检测要领，对付人类康健和生态情况具有现实意义。磺胺类药物是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的化学药物，种类达到数千种，其中应用较广并有确切疗效的有数十种，由于其价格便宜、使用方便，广泛应用于动物疾病防治和促生长p，4]。然而，磺胺药物残留引发的一系列问题日益凸显，为此欧盟、加拿大和美国规定磺胺药物MRL值为100ngmL_i[5]，日体蛋白理论上可以结合所有对应配体，是一类药物真正意义上的广谱别材料，是突破制约的方式之一。本研究以磺胺类药物受体蛋白二氢叶酸合成酶为研究对象，建立基于二氢叶酸合成酶

3、的快速检测方法检测牛奶中磺胺类药物多残留。同时，为进一步提高方法灵敏度，通过分子对接技术研究二氢叶酸合成酶与磺胺类药物作用机制，为蛋白体外进化突变提供理论依据。...................................1.2磺胺类药物1.2.1概述磺胺类药物可以根据内服后吸收情况分为三类：肠道易吸收磺胺、肠道难横胺和外用磺胺。常用磺胺结构及分类，如表1-1所示。1.2.2理化性质磺胺类药物一般为白色或微黄色结晶性粉末，无臭，味微苦，遇光易变质，色渐变深，大多数本类药物在水中溶解度极低，较易溶于稀碱，但形成钠盐后则易溶于水，其水溶液呈强碱性。易溶于沸水、甘汕、盐酸、a

4、氧化钾及氮氧化钠溶液，不溶于氣仿、乙醚、苯、石油醚。1.2.3作用机制细菌体内的二氢叶酸合成酶催化对氨基苯甲酸生成叶酸合成的中间产物，如图1-2所示，擴胺药与对氨基苯甲酸在分子大小和电荷分布方面相似，在细菌体内与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成藤的反应位点，抑制叶酸的合成，进而抑制了细菌的生长繁殖。磺胺并没有杀死细菌，只起到抑制作用，还要靠动物或人体免疫系统杀死细菌。动物或人类不能合成叶酸而必须从食物中获取叶酸，因此磺胺类药物不会影响人体细胞的叶酸代谢。......................................第二章磺胺类药物受体蛋白DHPS制备及鉴定2.1试验材

5、料2.1.1菌株肺炎链球菌(StreptococcuspneumoniaeR6)购自美国菌种保藏中心（AmericanTypeCuLtureCollection.ATCC)，编号49619。大肠杆菌(Escherichiacoif)购自自美国菌种保藏中心（AmericanTypeCuLtureCollection，ATCC)，编号25922。2.1.2试剂pET-28b载体德国Merk公司大肠奸菌Trans5(x北京全式金生物有限公司大肠杆菌BL210OE3)日本Takara公司T4DNALigase试剂盒美国Promega公司His?Bind?Columns德国Merk公司N

6、deI日本Takara公司XhoI日本Takara公司PCRMix日本Takara公司pEASY-ElExpressionKit北京全式金生物有限公司细菌基因组提取试剂盒天根生物科技有限公司DNA胶回收试剂盒天根生物科技有限公司质粒提取试剂盒天根生物科技有限公司卡那霉素天根生物科技有限公司琼脂糖天根生物科技有限公司IPTG天根生物科技有限公司X-Gal天根生物科技有限公司DNAMarker天根生物科技有限公司蛋白MarkerMBIFermentas公司LB培养基北京陆桥技术有限公司两稀酷胺上海生工N，N-甲叉双丙稀酰胺上海生工Tresco公司SDSAmresco公司Tris-H

7、ClAmresco公司TrisAmresco公司甘氣酸Amresco公司TEMEDSigma公司Anti-Hisantibody天根生物科技有限公司增强型HRP-DAB底物显色天根生物科技有限公司Goatanti-mouseIgG-HRP美国Bio-Rad公司...................................2.2试验方法2.2.1重组克隆载体pEASYTM-Tl-y的构建及鉴定2.2.1.1基因组DNA提取采用天根细菌基因组提取试剂盒（DP302)提取肺炎链球菌R6的基