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1、EB病毒gp85N端片段的原核表达与初步鉴定论文.freelinaltruncatedglycoproteingp85ofEpsteinBarrvirusAbstractAIM:ToconstructaprokaryoticrebinantvectorofEpsteinBarrvirus(EBV)membraneproteingp85,toexpresstheproteininE.coliandcharacterizetheantigenicityofthisnonglycosylatedprotein.METHODS:TheBXLF2genecoding5′
2、terminaltruncatedofEBVgp85plifiedfromtheEBVstrainB958celllineers.AfteridentificationbytherestrictiondigestionidpGEX5Tandconfirmedbysequencing.TheconstructedprokaryoticexpressionvectorpGEX5T85NedintothepetentE.coliBL21.Theexpressedrebinantproteingp85Natography,characterizedbyED公司。抗gp
3、85的单克隆抗体（mAb）由美国Florida大学HuttFletcher博士赠送。其他常规化学试剂均为分析纯。PE2400型DNA扩增仪ABI公司产品。TransBlotSD半干电转印仪及FluorSTMMultilmager凝胶成像系统为BioRad公司产品。1.2方法1.2.1BXLF2基因N端片段的PCR扩增根据EB病毒的膜蛋白gp85BXLF2基因的序列,设计一对引物。P1:5′CGAAGCTTTGCAGTTGCTCTGTGTT3′含HindⅢ酶切位点,P2:5′CGCTCGAGATGCAGTTGCTCTGTGTT3′含XhoⅠ酶切位点。以EB病毒B
4、958细胞为模板,总PCR反应体积为50μL,包括引物P1、P2各30pmol,dNTP125μmol/L及TaqDNA聚合酶2U。PCR扩增条件:94℃预变性2min,94℃30s,50℃30s,72℃45s,共30个循环后,于72℃再延伸5min。PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。1.2.2重组质粒的构建和转化将上述PCR产物分别用HindⅢ和XhoⅠ双酶切,并与同样双酶切的GST融合表达载体pGEX5T进行连接,构建pGEX5T85N。以重组质粒转化感受态E.coliBL21细胞,阳性克隆进行双酶切鉴定,并将菌液送上海生物工程公司进行DNA序
5、列测定。1.2.3GSTgp85N融合蛋白的诱导表达挑取重组菌的单个菌落,接种于25mLLB(含氨苄青霉素)培养基中,于37℃摇床培养过夜。次日,按1∶30转种于500mLLB培养基中,于37℃振荡培养至A600=1.0左右,加IPTG（终浓度为0.4mmol/L）于18℃诱导表达20h;同时取1管未加IPTG作为阴性对照。菌液离心,收集菌体,重悬于8mLPBS（含10mL/LTritonX100及1g/L溶菌酶）中,于-70℃反复冻融以裂解菌体。以10000g离心收集上清和菌体沉渣,分别取少量进行100g/LSDSPAGE。1.2.4重组蛋白的纯化取上述菌体
6、的裂解上清,按说明书的方法,用谷胱甘肽亲和层析柱进行分离纯化,纯化产物的纯度经100g/LSDSPAGE进行分析。1.2.5小鼠抗gp85N抗血清的制备以Bradford法测定蛋白浓度,按100μg纯化的gp85N抗原加入等体积的福氏完全佐剂,乳化后采用皮内、背部多点注射免疫5只6周龄的BALB/c雌性小鼠。初次免疫后,每隔3周用同样抗原加等体积福氏不完全佐剂加强免疫2次。1.2.6抗血清效价的测定经优化条件,将纯化的gp85N抗原用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至10mg/L包被酶标微孔板,于4℃过夜。以PBS洗涤后,加含10g/LBSA的PBS封闭2h。充分洗
7、涤后,分别加入不同稀释度和不同免疫周期的小鼠血清及抗gp85mAb,同时以PBS免疫小鼠的血清作为空白对照,以HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗,用底物TMB显色后,于波长450nm处测定抗血清的效价。1.2.7目的蛋白表达的r约为589bp处有一扩增条带,同预期的目的基因片段的大小相一致（图1）。图1BXLF2基因N端片段PCR产物的琼脂糖分析（略）Fig1AnalysisofthePCRproductofNterminalfragmentofBXLF2genebyagarosegelelectrophoresis1:NterminalfragmentofB
8、XLF2gene;M:DNAmarke
