高效液相色谱串联质谱法测定猪肉中泰拉霉素残留论文

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1、高效液相色谱串联质谱法测定猪肉中泰拉霉素残留论文刘勇军,吴银良姜艳彬沈建忠【摘要】建立了高效液相色谱串联质谱(HPLCMS/MS)测定猪肉样品中新型兽药泰拉霉素残留的方法。样品用V(甲醇)∶V(0.1%H3PO4)=70∶30混合溶液提取，经离心后用PCX固相萃取小柱净化,以SymmetryC8色谱柱为分离柱，在串联质谱多反应监测(MRM)模式下检测，内标法定量。方法的线性范围为10～500μg/kg，检出限为5.0μg/kg，在3个浓度水平(10，20和50μg/kg)进行添加实验，平均回收率为9

2、3.1%～105.5%;批内相对标准偏差为1.5%～4.6%;批间相对标准偏差为1.8%～5.6%。【关键词】高效液相色谱串联质谱.freelycin)是一种新近上市且为动物专用的大环内酯类半合成抗生素，分子式为C41H79N3O12(分子量806)，其分子结构如图1所示。我国农业部在2008年第957号公告中首次批准使用泰拉霉素。泰拉霉素主要用于放线杆菌、支原体、巴氏杆菌、副嗜血杆菌引起的猪、牛的呼吸系统疾病。具有用量少、一次给药、低残留、动物专用等优点1,2。我国广泛使用的大环内酯类药物为泰乐菌素和替

3、米考星，虽然这两种药物的使用效果良好，但随着使用时间的延长，图1泰拉霉素分子结构式Fig.1Structureoftulathromycin在很多地区出现了不同程度的耐药性3，而泰拉霉素药效强于泰乐菌素、替米考星和氟苯尼考等市场广泛使用的大环内酯类药物，因此，泰拉霉素必将在畜禽生产中大量使用。作为一种新药，泰拉霉素的残留检测方法的研究尤为必要。目前，大环内酯类药物残留检测方法有ELISA筛选法4、薄层色谱法5、气质联用法6、高效液相色谱7～10和高效液相色谱串联质谱法等11，12。有关泰拉霉素的残留检测研究

4、较少13。本研究建立了以罗红霉素(C41H76N2O15,837)为内标的泰拉霉素的HPLCMS/MS检测方法，方法的定量限为10μg/kg，可以满足有关法规对大环内酯类药物的检测要求，为动物组织中泰拉霉素的残留监控提供技术支持。2实验部分2.1仪器与试剂icroTMAPI高效液相色谱串联质谱仪(美国S1Minishaker旋涡混合器;EEVAP水浴氮气吹干仪(美国Organomation公司);超纯水器(美国MilliQ公司)。泰拉霉素标准品与罗红霉素内标(Sigma公司)、乙腈、甲醇、H3PO4为

5、色谱纯;甲酸、KH2PO4、NH3·H2O为分析纯;实验室用水为MilliQ高纯水。2.2标准溶液的配制泰拉霉素标准储备液：准确称取泰拉霉素10.0mg，用V(0.05mol/LK2HPO4)∶V(乙腈)=75∶25(pH6.0)定容至10mL，摇匀，置冰箱冷藏储存，有效期3个月。内标物罗红霉素的配制方法同泰拉霉素。添加溶液的配制：吸取储备液1mL于100mL容量瓶中并用V(0.05mol/LK2HPO4)∶V(乙腈)=75∶25(pH6.0)混合液定容，再从中吸取1mL于50mL容量瓶中得添加液浓度为0

6、.2mg/L(冰箱冷藏储存，有效期2个月)。2.3内标物质的确定由于大环内酯类药物的同位素内标物质很少,至今无泰拉霉素同位素内标物出售。而测定大环内酯类药物的检测方法研究和标准修制订一般采用外标法或者采用大环内酯类某种结构相似药物作为内标物来进行定量分析。本实验选用一种没有用于兽药用途且结构与泰拉霉素非常相似的大环内酯类药物罗红霉素作为内标,分子结构如图2所示。图2内标物罗红霉素分子结构式Fig.2Structureofroxithromycinasinternalstandard2.4供试样品溶液的制备称

7、取2.0g组织样品于50mL聚四氟乙烯塑料管中，加入10mL提取液(V(甲醇)∶V(0.1%H3PO4)=70∶30)和适量内标工作液，7800r/min匀质1min后，5000r/min离心2min，收集上清液过已经分别用3mL甲醇和3mL提取液润洗过的60g/3L的PCX小柱，待全部过柱后，再用3mL水、3mL甲醇淋洗，最后用4mL4%氨化甲醇洗脱，50℃水浴氮气吹干后用1mL流动相定容，进行HPLCMS/MS分析。2.5LCMS/MS分析条件SymmetryC8柱(20mm×3.9mm，5μm)

8、，流动相：V(乙腈)∶V(0.1%甲酸水溶液)=70∶30;柱温：30℃，进样室温度15℃，进样量：10μL，流速为0.3mL/min。ESI(+);多级反应检测(MRM);毛细管电压：4.2kV;锥孔电压：20V;RF透镜电压：0.2V;离子源温度：110℃;脱溶剂气温度：350℃;锥孔气流速：50L/h;脱溶剂气流速：600L/h;倍增器电压：650V;二级碰撞气：氩气。3结果与讨论3.1样品的提取和净化泰拉