dna提取与鉴定2010-03

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1、动物组织ＤＮＡ的提取与鉴定陈　彦安徽大学生命科学学院生物科学和生物工程专业生化与分子生物学实验实验1、Sephadex-G50分离蛋白质实验2、动物基因组的制备及其鉴定实验3、糖类化合物的提取及ＴＬＣ分析实验4、蛋白质的FPLC分离与定量测定实验5、质粒DNA的小量制备实验6、质粒DNA的酶切及电泳鉴定实验7、大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化实验8、聚合酶链式反应技术实验9、DNA的体外重组分离纯化核酸原则与要求1.应保证核酸一级结构的完整性完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求)2.排

2、除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的污染应降低到最低程度；无其他核酸分子的污染，例如提取DNA分子时，应去除RNA分子3.减少化学因素对核酸的降解避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4～10条件下进行4.减少物理因素对核酸的降解强烈振荡、搅拌，将细胞突置于低渗液中，细胞裂解、反复冻贮等造成的机械剪切力以及高温煮沸等条件都能明显破坏大分子量的线性DNA分子．对于分子量小的环状质粒DNA及RNA分子，威

3、胁相对小一些。5.防止核酸的生物降解细胞内、外各种核酸酶作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。DNA酶需要Mg2+，Ca2+的激活，因此实验中常利用金属二价离子螯合剂EDTA，柠檬酸盐，可基本抑制DNA酶的活性RNA酶不但分布广泛，极易污染，而且耐高温、耐酸碱，不易失去活性，所以生物降解是RNA提取过程的主要危害因素。进行核酸分离时最好用新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮或一70℃的冰箱中。DNA在细胞内的分布核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在

4、。真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的染色体DNA、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA为单链环状分子；95％的真核生物DNA主要存在于细胞核内,其他5％为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等DNA的性质DNA是很惰性的化学物质，双链由氢键紧密相连，其碱基对外侧受磷酸和糖的保护，并由于其内部的碱基堆积力而进一步加强，使DNA在细胞内比其他成分更具化学耐久性。因此在氯仿等使蛋白质变性的条件下，DNA分子仍然稳定。真核生物中的染色体DNA与碱性蛋白(组蛋白)结合而成核蛋白(DNP)形式

5、而存在于核内。DNP溶于水和浓盐溶液(1-2mol/L氯化钠)，但不溶于生理盐溶液中(0.14mol/L氯化钠)，而RNP此时的溶解度较大，因此可利用这一性质，将DNP与RNP分离。DNA在乙醇中形成絮状沉淀，使DNA最终得以分离真核生物基因组DNA分离纯化的基本步骤真核生物的一切有核细胞(包括培养细胞)都可以用来制备基因组DNA。提取方法包括两步：1、先温和裂解细胞及溶解DNP，而后使DNP与RNP分离，再使核蛋白解离，释放出DNA.真核细胞的破碎有各种手段，包括超声波破碎法、匀浆法、液氮破碎法、低渗法等

6、物理方法及蛋白酶K和去污剂温和处理法，为获得大分子质量的DNA，一般多采用后者温和裂解细胞。高分子质量DNA在物理上仍是易碎的，在溶液中，长而弯曲的DNA分子随机卷曲，并因碱基堆积力和磷酸基团间的静电排斥力变得粘滞，容易受到吸液、振荡、搅拌等引起的流体剪切力作用而断裂，因此，基因组DNA容易成片断获取，但所需分子质量越大，获得的难度也相应增加，大于150kb的DNA分子在常规分离方法中多被切断。去除蛋白质常用酚、氯仿抽提，反复抽提操作对DNA链机械剪切机会较多，因此有人使用80％甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方

7、法，可得小于200kb的DNA片段。2.采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNA及其他大分子猪脾脏DNA提取与鉴定【实验目的】掌握浓盐法提取与鉴定动物组织DNA的原理和方法。【实验原理】核酸类化合物都溶于水而不溶于有机溶剂。所以核酸可用水溶液提取，而用有机溶剂沉淀法沉淀分离。在细胞内，RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（RNP），DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（DNP）。在０.14mol／L的氯化钠溶液中，RNP的溶解度相当大，而DNP的溶解度仅为在水中溶解度的1％；当氯化钠的浓度达到1mol／L的时候，RNP

8、的溶解度小，而DNP的溶解度比在水中的溶解度大2倍。所以常选用０.14mol／L的氯化钠溶液提取RNP，而选用1－２mol／L的氯化钠溶液提取DNP。核酸提取液中含有的蛋白质、多糖等可以用沉淀分离法除去。在核酸提取液中加入氯仿-戊醇或氯仿-辛醇，振荡一段时间，使蛋白质在氯仿一水界面上形成凝胶状沉淀而离心除去，核酸仍留在水溶液中。核酸都不溶于有机溶剂，可在核酸提取液中加入亲水有机溶剂（乙醇），使DNA或RNA呈絮状