银杏叶提取物对哮喘小鼠气道重塑的影响及机制论文

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1、银杏叶提取物对哮喘小鼠气道重塑的影响及机制论文【摘要】目的：探讨哮喘小鼠气道重塑与基质金属蛋白酶9（MMP9）的关系以及银杏叶的干预作用.方法：建立哮喘小鼠气道重塑模型，40只BALB/c小鼠按随机数字法分为4组：对照组，哮喘组，银杏叶干预组，地塞米松干预组.以鸡卵清蛋白（OVA）致敏并激发制备小鼠慢性哮喘模型.对肺组织切片行苏木精伊红染色观察气道重塑情况.RTPCR检测各组小鼠肺组织MMP9mRNA表达.结果：哮喘组动物出现管壁增厚、平滑肌增生、黏液分泌增加等气道重塑的特征性改变,MMP9mRNA水

2、平增高.地塞米松干预组和银杏叶干预组与哮喘组比较,炎症反应轻微,平滑肌增生、粘液分泌不明显,MMP9mRNA水平表达降低,与对照组比较差异有统计学意义.结论：长期吸入变应原可导致气道重塑，MMP9在气道重塑中发挥了作用，银杏叶的干预作用说明在血小板活化因子（PAF）和MMP9之间可能存在某种联系.【关键词】哮喘MMP9道重塑银杏叶0引言气道重塑是慢性哮喘反复发作的重要病理生理基础，它与哮喘肺功能损害及气道高反应性密切相关［1］.MMP9是锌依赖性蛋白酶.freelin，OVA)，Ⅴ级，购于Sigma公司

3、.银杏叶提取物（Ginkgobilobaextract,Egb,含240g/L银杏黄酮苷，60g/L银杏内酯，5mL，批号：0404018)，购于德国威玛舒培大药厂.Trizol购于Invitrogen公司，反转录试剂盒和PCR试剂购于Toyobo公司，MMP9及GAPDH引物由上海鼎安生物科技有限公司合成.1.2方法1.2.1小鼠哮喘模型的建立40只小鼠按随机数字法分为4组：对照组，哮喘组，地塞米松干预组，银杏叶干预组.小鼠适应性饲养1L致敏液（含OVA300mg，氢氧化铝100mg）.第15日开始每日以25

4、g/LOVA雾化激发，30min/d，共6g/kg地塞米松注射液；银杏叶干预组每次激发前1h腹腔注射100mg/kgEgb；哮喘组每次激发前1h腹腔注射0.2mL生理盐水,对照组于第0,7,.freelL生理盐水，15d始用生理盐水雾化6RNA的表达Trizol试剂提取总RNA，分别将RNA2μL,随机六聚体1μL，ddH2O9μL,MMLV反转录反应缓冲液4μL,RNasin1μL,dNTPs2μL,MMLV1μL依次加入反应管中,按反转录试剂盒说明书进行反转录.内参照引物和MMP9基因PCR扩增产物设计与合

5、成:根据GenBank上发表的管家基因GAPDH和MMP9的序列,利用PrimerPremier5.0软件设计了可以扩增的引物：GAPDH上游引物为5′CATCACTGCCACCCAGAAGA3′,下游引物为5′TGAAGTCGCAGGAGACAACC3′,扩增片段长度为320bp；MMP9基因上游引物为5′GTGTGTTCCCGTTCATCTTT3′,下游引物为5′ATGCCGTCTATGTCGTCTTT3′，扩增片段长度为454bp.分别取反转录产物2μL,10×PCR反应缓冲液5μL,dNTPs1μL,

6、上下游引物各1.25μL,Taq酶0.5μL,加ddH2O补足至25μL,在PCR扩增仪中进行反应,反应条件为94℃预变性4min；95℃变性15s；58.5℃退火1min；72℃延伸2min，35个循环.同时，PCR扩增管家基因GAPDH作为检验反转录是否成功的标准.各取5μLPCR产物做10g/L琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察.统计学处理:采用SPSS11.0统计软件，数据以x±s表示，组间均数比较采用方差分析及LSDt检验，以P0.05为差异有统计学意义.2结果2.1慢性哮喘气道重塑模型对照组行动敏

7、捷，一般情况未见异常.哮喘组经激发后，出现呼吸急促，口唇发绀，腹部翕动，易激惹，烦躁不安.地塞米松干预组、银杏叶干预组也出现哮喘组情况，但症状明显减轻.2.2肺组织病理学改变光镜下观察，与对照组相比，哮喘组小鼠气道壁及气道平滑肌明显增厚，黏膜下水肿，黏膜下层增宽，可见黏液栓堵塞，气道上皮细胞脱落，杯状细胞增多，黏膜下及管周有大量炎性细胞浸润，可见淋巴滤泡.地塞米松干预组以及银杏叶干预组上述改变较哮喘组明显减小（图1）.A:对照组小鼠气道无明显增厚、内壁光滑，气道周围无炎性细胞浸润，肺泡壁结构完整;B:哮喘组小鼠气

8、道平滑肌层明显增厚，管壁周围大量炎性细胞浸润，肺泡有明显出血;C:地塞米松干预组小鼠气道增厚明显减轻，管壁周围少量炎性细胞浸润;D:银杏叶干预组气道壁增厚也见减轻，炎性细胞减少.图1各组小鼠肺组织石蜡切片HE×4002.3肺组织MMP9mRNA表达应用RTPCR对MMP9mRNA水平表达量进行检测提示，哮喘组MMP9mRNA表达量高于正常对照组，而地塞米松干预组表