hplc法测定乙肝清热解毒片中两种黄酮类成分的含量论文

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1、HPLC法测定乙肝清热解毒片中两种黄酮类成分的含量论文.freelm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈—甲醇—0.2%磷酸（10∶45∶60），检测波长为370nm，流速为1.0ml/min，进样量为20μl，柱温为35℃。结果槲皮素、山奈素检测浓度的线性范围分别为4.2～25.2μg/ml（r=0.9994）、0.97～5.82μg/ml（r=0.9996）；平均回收率分别为97.56%，98.76%.freelm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈—甲醇—0.2%磷酸（10∶45∶60）；检测波长：370nm；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；进样量：20

2、μl。2.2对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷干燥12h的槲皮素、山奈素对照品适量，加甲醇制成含槲皮素1.05mg/ml、山奈素0.2425mg/ml的混合对照品贮备液，备用。取混合对照品贮备液0.08ml于10ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度，即得对照品溶液。2.3供试品溶液的制备取乙肝清热解毒片20片，研细，精密称取粉末约5g，置烧瓶中，加入甲醇20ml和盐酸1ml，摇匀，置水浴中加热回流2h，迅速冷却到室温，滤过，滤液转移入25ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即可。2.4阴性样品溶液的制备取不含白花蛇舌草的空白片，按“2.3”项下方法制备不含

3、白花蛇舌草的阴性样品溶液。2.5专属性试验分别取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果表明空白溶液色谱图在槲皮素、山奈素保留时间处未显示色谱峰，专属性良好。色谱见图1。2.6线性关系考察分别精密吸取对照品贮备液0.04、0.08、0.10、0.12、0.16、0.20、0.24ml于10ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度，制成系列对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，以峰面积（A）对浓度（C）进行线性回归，得槲皮素、山奈素的回归方程分别为A=62498C+4392（r=0.9994）、A=67443C+3071.7（r=0.9996）。

4、结果表明：槲皮素、山奈素检测浓度线性范围分别为4.2～25.2μg/ml和0.97～5.82μg/ml。2.7精密度试验取对照品溶液20μl，于室温下放置0、2、4、6、8、24h后进行测定，结果槲皮素、山奈素的RSD分别为0.69%、0.50%，表明日内精密度良好。取同一份对照品溶液于0、1、2、3、4天测定，结果槲皮素、山奈素的RSD分别为0.78%、0.62%，表明日间精密度良好。2.8稳定性试验取供试品溶液（批号：20070501）于0、2、4、6、8、24h进行测定，结果槲皮素、山奈素的RSD分别为0.83%、1.10%，表明样品在24h内稳定。2.9加样回

5、收率试验精密称取已知含量的样品5g，加入一定量的槲皮素、山奈素对照品，按供试品溶液制备方法操作，得加样回收测定溶液。按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果见表1。表1回收率试验结果（略）2.10样品含量测定分别取3批乙肝清热解毒片，同“2.3”项下方法，制备供试品溶液，进样测定，结果见表2。表2样品含量测定结果（略）3讨论3.1本实验采用甲醇提取与盐酸甲醇提取进行比较，结果经盐酸甲醇提取的槲皮素、山奈素含量明显高于甲醇提取。故选择盐酸甲醇水解法。3.2文献报道槲皮素的检测波长为360nm［2］和370nm［3］，本实验取对照品甲醇溶液，以甲醇为空白，自200～450n

6、m作紫外线扫描，在370nm处均有最大吸收，且峰顶延缓。故选370nm为检测波长。3.3通过对不同甲醇—0.2%磷酸比例的流动相进行选择，结果发现槲皮素、山奈素保留时间随甲醇浓度增大而缩短，加入适量乙腈能达到更好的分离效果，选择乙腈—甲醇—0.2%磷酸（10∶45∶60）为流动相，分析时间适中，且样品中槲皮素、山奈素达到良好的分离。3.4采用水浴加热回流提取与超声提取进行比较，结果水浴加热回流提取槲皮素、山奈素含量明显高于超声提取，说明加热更有利于糖苷的水解。3.5黄酮类成分在HPLC测定中易出现拖尾现象，在流动相中加入酸类可有效抑制拖尾，提高其峰形的对称性，经多次测

7、定，系统具有良好的重现性和稳定性。【