氯离子通道阻断剂对大鼠离体海马神经元凋亡的影响

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1、氯离子通道阻断剂对大鼠离体海马神经元凋亡的影响作者：常全忠张淑玲蔡仕宁尹金宝【摘要】　　目的通过观察氯离子（Cl-）通道阻断剂对一氧化氮（NO）供体3吗啉斯德酮胺（SIN1）诱导的大鼠离体海马神经元凋亡的效应，探讨Cl-通道在缺血性脑损伤中的作用。方法离体培养12d的SD大鼠海马神经元，随机分为正常对照组、SIN1处理组、SIN1处理后和Cl-通道阻断剂组，对各组神经元分别在相应的时间点进行Hoechst荧光染色观察凋亡细胞数和MTT实验定量检测神经元的存活率。结果SIN1能明显诱导神经元凋亡（P<0.

2、05），SITS和DIDS呈剂量依赖性地抑制NO诱导的神经元损伤，提高神经元的存活率，与SIN1组相比差异显著（P<0.05）。结论Cl-通道阻断剂对NO诱导的大鼠海马神经元凋亡有一定的保护作用。【关键词】氯离子通道；NO；海马；大鼠；凋亡【Abstract】ObjectiveToobservetheeffectsoftpalneuronaldamageinducedbyNOincultureandexploretherolesofchloridesinthecerebralischemicinjury.Met

3、hodsTheculturesent,NOtreatmentpluschloridechannelblockergroups.Theculturesethodsofmorphologicalstain(Hoechst33258)andMTTquantitativeanalysistoobservetheapoptoticneuronsandneuronalviabilities.ResultsThereageeprotectiveeffectsagainstneuronalinjuryinducedbyNO.【Keyp

4、us;Rat;Apoptosis　　在缺血性脑神经元死亡的离子机制研究方面，关于钙离子（Ca2+）通道和钾离子（K+）通道参与神经元凋亡的研究报告较多，而对氯离子（Cl-）通道的作用报告不多。在星状孢子素STS诱导小鼠皮层和NMDA诱导大鼠海马神经元损伤模型上，用Cl-通道阻断剂DIDS对神经元的损伤有明显保护作用〔1,2〕。有研究认为，不是Ca2+和K+的活动而是Cl-通道的活动参与了STS诱导的大鼠皮层神经元的损伤〔3〕。本研究模拟缺血性脑损伤的发生机制，利用3-吗啉斯德酮胺(SIN1)作为一氧化氮（NO）供体诱

5、导离体大鼠海马神经元凋亡，观察Cl-通道的活动是否参与神经元的凋亡过程，探讨缺血缺氧敏感性神经元的凋亡与Cl-通道活动之间关系。　　1材料和方法　　1.1动物和试剂　　新生1d的SD大鼠（遵义医学院动物中心提供）；DMEM/Ham′sF12培养基（购自GibcoBRL公司），多聚赖氨酸（polyDLysine，PLL）、阿糖胞苷、SIN1、4乙酰氨基4′异氰酸芪2,2′二磺酸（SITS）、二异硫氰基苯2,2′二磺酸（DIDS）、Hoechst33258等试剂购自美国Sigma公司；胎牛血清（杭州四季

6、青公司）；抗Caspases3（SantaCruz）。　　1.2海马神经元的培养　　参照方法〔4〕取生1d内的SD大鼠，雌雄不拘，无菌断头取脑，分离双侧海马，用0.25%胰蛋白酶37℃消化15min，加基础培养基终止消化，机械吹打分散细胞，500目筛网过滤，1000r/min室温离心10min，去上清液，加完全培养基，吹打分散细胞后制成4×105个/ml的单细胞悬液，接种在预先包被有PLL的24孔或96孔培养扳内，通以95%空气、5%CO2，37℃饱和湿度下培养。培养液中含有90%DMEM/F12、10%胎牛血清，

7、2mmol/L谷氨酰胺、100IU/ml青、链霉素。接种48h后更换培养液，同时加入1×10-5mol/L阿糖胞苷作用48h，以抑制胶质细胞的过度增殖。以后每周更换培养液2次。　　1.3实验分组　　取培养9d的海马神经元，随机分为：正常对照组（仅用完全培养基）；SIN1处理组：1.0mmol/LSINH作用18h；SIN1处理后加Cl-通道阻断剂组：SITS浓度分别为：0.05、0.3、0.5、1.0、2.0mmol/L；DIDS浓度分别为10、50、100、200、300mmol/L。观察Cl-通道阻断剂的效应时

8、与SIN1同时加入培养基内，作用18h。　　1.4形态学观察　　取培养的各组神经元，用0.01mol/LpH7.4的PBS冲洗1次，用4%多聚甲醛固定15min，空气干燥后Hoechst33258（5μg/ml）染色15min，用0.01mol/LpH7.4的PBS冲洗2次，倒置荧光显微镜观察细胞核的形态。每次随机数3个视野内2