基因芯片分析汉黄芩素抗肿瘤影响机制

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1、基因芯片分析汉黄芩素抗肿瘤影响机制前言恶性肿瘤己成为危害人类的健康的第一大杀手⑴。目前临床治疗肿瘤的方法主要有手术治疗、化学治疗、放疗治疗和生物治疗等多种方法[2]。外科手术适用于某些局部性肿瘤早期和中期的治疗，但多数病人靠手术治疗是不能防止肿瘤的复发和远处转移的[3]；放、化疗虽然有相当高的治愈率，但是常引起如骨髓抑制、免疫低下等毒副反应，使患者难以坚持治疗[3]；化疗药物在治疗过程中出现的耐药性，已成为目前临床治疗中的难题之一[3]。所以幵发新型的高效、低副作用和具有肿瘤勒向性的抗肿瘤药物迫在眉睫。近年来，传统的中药作为一种新型的抗癌药物

2、获得了相当大的关注。黄酮类化合物以广、种类多、安全性强、选择性强、抗肿瘤谱广泛、抗肿瘤细胞增殖作用效果明显、毒副作用小等特点，成为国内外蹄选抗肿瘤药物的重要资源之一[4]。汉黄零素(a公司）中，配制成终浓度为200mmol/L的母液，过滤后于-20°C冰箱冷冻保存备用。实验前加培养液稀释至所需浓度(DMSO终浓度<0.01%)。高糖DMEM培养液、RPMI-1640培养液为美国GIBCO公司产品。胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)为美国Hyclone公司产品。胰蛋白酶(trypsin)为美国Hyclone公司产

3、品。青霉素-链霉素双抗试剂为美国Hyclone公司产品。二甲基亚砜(DMSO)为美国Sigma公司产品。憐酸缓冲液(PBS)为美国Hyclone公司产品。四甲基偶氮挫蓝(methylThiazolylTetrazolium，MTT)干粉为美国Sigma公司产品。AnnexinV-FICT/PI细胞洞亡检测试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品。凯基细胞DNA含量检测试剂盒(细胞周期)为南京凯基生物科技发展有限公司产品。结晶紫群落染色试剂盒为上海杰美基因医药科技有限公司产品。2方法2.1细胞培养Transl,各组分别吸取200接种于上层小室，

4、将小室置于24孔板，下室加入含10%胎牛血清的培养液，培养24h后。取出Transin后，用棉签头轻轻擦掉小室上层未迀移的细胞，PBS洗3遍。显微镜下观察细胞，随机取五个视野记数。并按公式1-2计算细胞迁移抑制率。汉黄零素处理肿瘤细胞24h后，在一定浓度范围内(；12.5~200
11101/10，对Huh7细胞和SGC-7901细胞无明显抑制作用CP>0.05),而对HepG2细胞的抑制率与汉黄零素浓度大小呈正相关，即汉黄零素浓度越高，对HepG2肿瘤细胞的抑制率越高，见表1-1。汉黄零素对三种肿瘤细胞生长的抑制率与浓度之间的关系见图

5、1-1。取各种细胞的对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化后收集，以各自对应的完全培养液重悬，细胞计数，调整Hep>G2、SGC-7901、Huh7细胞密度依次为4.0><104、1.8><105、3X105个/mL。每种细胞分别独立接种于不同的96孔培养板中，常规培养24h。待细胞贴壁并进入对数生长期后进行实验千预。实验分6组：空白对照组(含10%FBS的培养液)；汉黄零素处理组(汉黄零素终浓度分别为12.5、25、50、100、200继续培养24h后，弃各孔中的旧液，加入10MTT(1mg/mL),37°

6、;C。然后弃各孔中的液体，MADMSO150孔，在振荡器上振荡15min，用全自动酶标仪490nm处测定各组吸光度值(即0D值)，并按公式1-1计算生长抑制率。以上各组均设8个复孔，实验平行重复三次。2.方法.........132.1细胞培养及处理.........132.2芯片实验基本流程.........132.3芯片数据处理与生物信息学分析.........132.4RT-PCR验证表达谱结果.........132.5统计学方法.........163.结果.........163.1基因芯片杂交后的扫描结果.........16

7、3.2芯片杂交信号散点图.........163.3基因芯片检测后数据结果.........174.讨论.........304.1细胞周期.........314.2MAPK信号通路.........324.3细胞迁移.........334讨论近年来，传统的中药作为一种新型的抗癌药物获得了相当大的关注。黄酮类化合物以安全性高、种类多、广、抗肿瘤细胞增殖作用效果明显，并具有抗肿瘤谱广、提高机体免疫力等特点，成为国内外蹄选抗肿瘤药物的重要资源之一[4]。但是由于中药药理作用广泛，常涉及机体以及细胞的多途径、多祀点，若仅对单个或少数几个基因进行

8、研究通常难以明确其作用靴点。基因芯片(genechip)又称DNA微阵列(DNAmicmarray)，该技术从基因组水平对某一剌激(如药物)进行检测，可以在同一时刻