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1、川芎嗪对缺血/再灌注损伤大鼠肾脏细胞凋亡及Bcl作者：王汉民，吴雄飞，谭华，陈光磊，李锋【关键词】川芎嗪；肾；再灌注损伤；细胞凋亡；基因,Bcl【Abstract】AIM:ToinvestigatetheeffectsofligustrazineoncellapoptosisandexpressionsofBcl2andBaxinratkidneysiareperfusion(I/R)injury,andstudythepossiblemechanismofrenalprotectionaffectedbyligustrazineag
2、ainstacuteI/Rinjury.METHODS:Forty100SX型透射电镜等.1.2方法1.2.1动物模型复制将动物随机分为4组，每组10只.即假手术对照组、缺血再灌注（I/R）组、I/R+川芎嗪治疗（I/R+T）组（再灌注30min后腹腔注射川芎嗪32mg/kg，每6h注射1次，共4次）和I/R+川芎嗪预防（I/R+P）组（于缺血前24,16,8h和45min腹腔注射川芎嗪32mg/kg，术后不再注射）.用30g/L戊巴比妥钠30～50mg/kg腹腔注射麻醉，经腹正中切口暴露双侧肾脏，游离肾蒂，用无损伤动脉夹同时钳夹双侧
3、肾动脉，阻断45min后松开动脉夹，肉眼可见肾脏由暗红变为鲜红，表明灌注成功，缝合切口，自由摄取水和食物.假手术对照组仅游离双侧肾脏，暴露60min后再关闭切口.24h后再用戊巴比妥钠麻醉大鼠，活体摘取左肾并采血，血标本以4000r/min离心10min，分离血清，置-20℃保存用于测定肌酐和尿素氮.肾组织用40g/L甲醛固定做原位凋亡及免疫组化检测，另取部分肾组织用30mL/L戊二醛固定做电镜观察.1.2.2肾功能指标用生化分析仪测定各组血肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）含量.1.2.3肾小管上皮细胞凋亡检测采用TUNEL法检测肾小管
4、上皮细胞凋亡指数（AI）.肾组织切片常规脱蜡入水，经30mL/LH2O2室温10min消除内源性过氧化酶，蛋白酶K消化，加入TdT和DigdUTP,37℃标记2h，加生物素化地高辛抗体封闭洗涤，加SABC,DAB显色，光镜观察凋亡细胞，胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞.于阳性表达分布区域在光镜200倍下随机选择5个无重叠视野，计数阳性细胞，以肾小管上皮凋亡阳性细胞数占总肾小管细胞数的百分比作为肾小管细胞AI.1.2.4肾组织Bcl2,Bax免疫组织化学检测及半定量分析切片常规脱蜡入水，3mL/LH2O2室温10min消除内源性过氧化酶，
5、微波进行抗原修复，加兔抗鼠Bcl2抗体（1∶100稀释）、Bax抗体（1∶150稀释）4℃过夜，次日依次滴加羊抗兔IgG二抗和SABC，最后在显微镜下用DAB显色.同时采用删除第一抗体的方法作为阴性对照.胞质中有棕色颗粒者为阳性细胞，每张切片于阳性表达区域选取5个低倍无重叠视野，应用图像分析系统计算吸光度（A）值并以此作为半定量参数反映Bcl2,Bax表达.A值越小，表示阳性产物Bcl2,Bax蛋白表达越多；Bcl2/Bax的A值越高，表示Bcl2/Bax越低.1.2.5电镜观察楔形切除左肾腹面半个肾组织的下极约3mm厚肾组织，置于3
6、0mL/L戊二醛磷酸盐缓冲液中固定24h（4℃），再以10g/L锇酸固定1.5h，常规脱水、包埋，制备透射电镜切片，在电镜下观察肾组织的超微结构.统计学处理：计量资料用x±s表示，采用SPSS12.0统计软件进行统计分析，两组比较用t检验，多组间比较用方差分析.P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异非常显著.2结果2.1各组肾功能的变化与假手术对照组比较，I/R组血BUN,Cr水平显著增高（P<0.05，表1）.与I/R组比较,I/R+T组血BUN,Cr水平轻度下降，但无统计学差异（P＞0.05），I/R+P组血BUN，Cr
7、水平较I/R+T组显著下降（P<0.05）.表1各组血清尿素氮及肌酐水平的比较2.2肾小管上皮细胞AI的变化假手术对照组少见凋亡细胞；I/R组凋亡细胞明显增多，多数是远端小管细胞，少数在近曲小管，肾小球未见凋亡细胞；I/R+T组细胞AI较I/R组无显著差异（P＞0.05）；I/R+P组细胞AI较I/R,I/R+T组显著减少（P均<0.05，表2）.表2各组肾小管上皮细胞凋亡指数(AI)及Bcl2,Bax和Bcl2/Bax的A值比较2.3Bcl2,Bax蛋白表达的变化与假手术对照组比较，I/R组Bax表达显著增强（P<
8、0.01），Bcl2表达略增强（P<0.05），Bcl2/Bax比值显著下降（P<0.01）；I/R＋T组Bcl2,Bax表达及Bcl2/Bax比值较I/R组无显著差异（P＞0.05）；I/R＋P组较I/R组
