碱性成纤维细胞生长因子及内皮细胞生长因子对兔韧带细胞增殖的影响

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1、碱性成纤维细胞生长因子及内皮细胞生长因子对兔韧带细胞增殖的影响【关键词】碱性成纤维细胞生长因子;内皮细胞生长因子;韧带;细胞增殖　　【Abstract】ObjectiveToobservetheeffectsofbasicfibroblastgromedialcollateralligament(MCL)andanteriorcruciateligament(ACL).MedthodsTheMCLandACLcellsoftenmatureNeedia,thecellularproliferationethod.ResultsTheadditionof1ng/mlbF

2、GFenhancedtheproliferationofMCLcellssignificantly,5ng/mlbFGFenhancedtheproliferationofACLcells,thisenhancementofproliferationofbothMCLcellsandACLcellsaximalintheconcentrationof50ng/ml.Theaditionof3.125ng/mlECGFenhancedtheproliferationofMCLcellssignificantly,12.5ng/mlECGFenhancedtheprolif

3、erationofACLcells.TheefficacyofbFGFandECGFdeclinedgraduallyentouscellsandtheycanenhancethehealingofligamentousissueinjuries.　　【Keyent,proliferation,ECGF　　韧带损伤是膝部的常见运动创伤，尤以内侧副韧带(medialcollateralligament,MCL)和前十字韧带(anteriorcruciateligament,ACL)多见，MCL和ACL是维持膝关节稳定的重要韧带，其损伤可使膝关节丧失稳定性，引起功能障碍，甚

4、至导致骨关节炎[21]。在中央实质部完全断裂后，MCL可自然愈合，有时不需手术介入;而ACL损伤后，即使手术缝合断端，其愈合率也较低。韧带损伤后的愈合过程与一般结缔组织相似，都经过急性炎症期、修复再生期和重塑或成熟期三个阶段[2]。研究表明[3]，在损伤韧带的局部存在着多种生长因子，它们被认为是韧带正常愈合过程的重要调节者。使用生长因子促进韧带愈合是近年来研究的焦点之一。通过体外培养MCL和ACL细胞，分别加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和内皮细胞生长因子(ECGF)，以观察bFGF和ECGF对韧带细胞增殖的影响，为应用bFGF和ECGF促进韧带创伤愈合提供依据。

5、　　1材料与方法　　1.1主要试剂bFGF(暨南大学生物医学工程研究所惠赠)，ECGF(Sigma公司产品，美国)，DMEM培养基及胰蛋白酶(Gibco公司产品)，胶原酶Ⅱ、XTT(Sigama公司，美国)，胎牛血清(杭州四季青生物有限公司),酶标仪(日本Reader)。　　1.2内侧副韧带和前十字韧带成纤维细胞培养无菌切取兔龄10周新西兰白兔MCL和ACL，在含100μg/mlPG和100μg/mlSM双抗Hank’s液中剔除滑膜等外周组织，以眼科剪剪成1mm3左右的碎片。配制0.25%的胶原酶Ⅱ，将韧带组织移至胶原酶液中，37℃条件下消化1～2h，组织消化后，无血清

6、DMEM培养液冲洗，离心，以含15%胎牛血清的DMEM培养液悬浮细胞，接种于一次性塑料培养瓶(Corning公司，美国)中，置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱内培养。每3d换液一次，待细胞汇合后，以胰蛋白酶消化传代。　　1.3XTT法测定韧带细胞增殖收获第2～5代的MCL和ACL细胞，以5×103/孔的浓度，接种于96孔培养板上，待细胞贴壁后，分别加入1、5、10、50、100及500ng/ml的bFGF和3.125、6.25、12.5、25、50及100ng/ml的ECGF。对照组不加bFGF和ECGF。每组四个复孔。CO2培养箱内培养，每天观察一次。培养3d后，

7、每孔加入50μlXTT(1mg/ml)。在37℃、5%CO2培养箱内继续孵育，3h后，在酶标仪上比色(参考波长650nm,测量波长450nm)，读取OD值。　　1.4统计学处理实验所得数据以SPSS11.0统计软件进行分析，用方差分析和Dunt法检验，α=0.05。　　2结果　　2.1膝关节韧带细胞培养膝关节韧带细胞贴壁时间约5～6d，体外培养条件下，ACL细胞的增殖速度明显慢于MCL细胞;ACL细胞原代生长约需13～15d，MCL细胞原代生长约需11～13d。1∶2传代的细胞不超过6代时，基本上能在5～7d内汇合成单层。ACL与MCL细