负载口蹄疫病毒vp1-vp4融合蛋白质树突状细胞启动t细胞应答

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1、摘要口蹄疫(foot-and-mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDvires，FMDV)感染偶蹄兽所引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。目前本病尚无有效的预防控制措施。FMDV衣壳由VFI、VP2、VF3和VP4四种结构蛋白组成，其中VPI为主要抗原位点，含丰富的T、B抗原表位，VP4虽位于衣壳内部，相对比较保守，也富含T抗原表位。实验证明，FMDV野毒株并不感染DCs，但在培养基上驯化的FMDV则可以感染DCs。尤其是被抗体IgG调理的FMDV，不仅可以感染DCs，导致其抗原提呈功能丧失，而且还造成DCs大量死亡，而当DC

2、s负载灭活FMDV免疫复合物后却能够有效地刺激T细胞。因此，人们开始重视机体对FMDV细胞免疫应答的机制研究。树突状细胞(Dendriticcells，DCs)是启动细胞免疫应答的专职抗原提呈细胞，可通过巨吞饮、受体介导的内吞和吞噬三种方式摄取外源性抗原，经过多种抗原提呈途径启动细胞免疫应答。目前尚不清楚DCs摄取FMDV抗原的方式以及DCs负载FMDV抗原后启动细胞免疫应答的机制。本研究以重组质粒pUC57．VPl为模板，通过PCR方法改变vPl一端的酶切位点，然后通过NcoI和BamHI位点将VPl基因插入到原核表达载体pET32a(+)，构建

3、pET-32a-VPl。然后用XhoI和BamH1分别对pBluescriptIISK(+)．VP4和pET-32a-VPl进行双酶切，构建pET-32a．VPl．VP4。将构建的pET-32a．VPl．VP4重组质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)，进行诱导表达。通过对诱导表达条件的优化，根据SDS．PAGE确定目的蛋白的最佳表达条件，利用载体的His．Tag标签和FMDV阳性血清分别进行Westernblot鉴定。本研究构建的原核表达系统pET-32a-VPl．VP4经酶切和测序鉴定，证明pET-32a-VPl．VP4构建成功。重组质粒转化BL

4、21(DE3)后经诱导表达和诱导条件优化，在分子量约为49kD处有一条明显的蛋白条带，在IPTG浓度为1mmol／L，30℃诱导后5h时表达量最大。通过电洗脱纯化VPl．VP4融合蛋白质。‘通过蛋白酶体抑制剂、溶酶体抑制剂、甘露糖受体抑制剂、清道夫受体抑制剂和巨胞饮抑制剂以不同组合处理骨髓源树突状细胞(BMDCs)，然后将VPl．VP4融合蛋白质负载处理后的BMDCs，与淋巴结T细胞共培养，以单独的BMDCs组和T细胞组为对照，在共培养后9、24、48、72和96h，取其共培养上清液，ELISA检测其中IFN吖和IL．4含量。结果显示，各组在各个时

5、间点上产生的IL-4的含量均显著低于IFN吖含量。蛋白酶体抑制剂处理组在每个时间点产生的IFN吖含量均低于不经抑制剂处理试验组，但高于溶酶体抑制剂处理组，说明溶酶体在BMDCs处理提呈VPl-VP4融合蛋白抗原的过程中发挥着更重要的作用。甘露糖受体抑制剂处理组在每个时间点产生的IFN-丫含量均高于不经抑制剂处理试验组(除24h，P>0．05)，说明甘露糖受体的识别作用对负载VPl．VP4融合蛋白之BMDCs活化T的过程发挥抑制作用；清道夫受体抑制剂处理组在每个时间点产生的IFN吖含量均高于不经抑制剂处理试验组，说明清道夫受体对负载VPl一VP4融合

6、蛋白的BMDCs启动T细胞应答也起到抑制作用；巨胞饮抑制剂处理组在每个时间点产生的IFN-7含量均明显低于甘露糖受体抑制剂处理组、清道夫受体抑制剂处理组和不经抑制剂处理试验组，说明巨胞饮是BMDCs捕获VPl．VP4抗原的主要方式。以上体外抗原提呈试验结果显示，负载FMDVVPl．VP4融合蛋白的BMDCs能够有效地激活淋巴结T细胞，巨胞饮是BMDCs摄取VPl．VP4融合蛋白抗原的主要方式，甘露糖受体和清道夫受体的识别作用对负载VPl．VP4融合蛋白之BMDCs启动淋巴结T细胞具有抑制作用。这些实验结果不仅为进一步研究BMDCs对FMDVVPl．

7、VP4融合蛋白质抗原的提呈机制打下了基础，而且对新型FMD疫苗的设计与开发也具有理论指导作用。关键词：口蹄疫病毒；VPl．VP4融合蛋白质；树突状细胞；抗原提呈；T细胞TcellresponsestriggeredbydendriticceHspulsedwithVPl一VP4fusionproteinoffoot-and-mouthdiseasevirusAuthor：LiNaSupervisor：．ProfessorWangJia-XinMajor：PreventiveVeterinaryMedicineAbstractFoot-and—mou

8、thdisease(FMO)isahiglllycontagiousdiseaseaffectingcloven-hoof