液相色谱基础009210

《液相色谱基础009210》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、液相色谱基础知识报告人：杨丹时间：09.09.21我们实验室的HPLC碳酸钙（固定相）色素混合液石油醚(流动相）1906年，俄国植物学家Tsweet发现植物色素分离现象色谱柱色带一、色谱起源液相色谱基础知识定义：色谱法是一种重要的分离分析方法，它是利用不同物质在两相中具有不同的分配系数(或吸附系数、渗透性)，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次反复分配而实现分离。固定相可以装在柱内，也可以做成薄层。前者叫柱色谱，后者叫薄层色谱。液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用气相色谱：以

2、气体作为流动相的色谱分离方法适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析流动相只起运载样品分子的能力液相色谱基础知识液相色谱基础知识反相液相色谱流动相极性大于固定相极性能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物正相液相色谱流动相极性小于固定相极性不溶于水/有机混合液的亲脂样品、异构体混合物和制备HPLC液相色谱基础知识采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配流动相的选择溶剂等级水的等级纯化水蒸馏水去离子水波长(nm)纯化水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物吸光率水/甲醇梯

3、度ODS柱鬼峰GradientCurve1ml/min,0-100%MeOHover10minsandholdfor15mins.溶剂等级鬼峰的出现溶剂等级溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱甲醇乙睛正己烷分析纯级(实线）和HPLC级溶剂（虚线）的吸光度比较溶剂等级GeneralMaintenanceandTroubleshooting缓冲液的使用使用前必须过滤使用后一定要对柱子进行清洗，以免造成腐蚀、磨损及阻塞

4、:首先用纯水冲洗10-30min(0.5-1ml/min)，再用甲醇冲洗30min(0.1-0.5ml/min)易受到细菌和霉菌的影响溶剂等级注意冲洗次序，不能直接用有机溶剂冲洗过滤：0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小物理颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是在使用无机盐配制的缓冲液的时候必须过滤脱气：除去在流动相中溶解或彼此混合而产生的气泡气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形3）检测器中的气泡产生基线波动无在线脱气应注意：1）每天脱气2）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过长溶剂前处理液相色谱基础知识梯度洗脱形式：线性

5、梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化和时间成线性比例指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈指数关系折线梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈跳跃关系梯度洗脱装置：高压梯度：高压泵将不同的流动相增压后送入梯度混合室混合,然后再送入色谱柱的方法。低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。梯度洗脱形式的选择液相色谱基础知识梯度洗脱：优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度，提高检测器的灵敏度注意事项：溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差梯度混合的溶剂互溶性要好梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检

6、测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）使用适宜的流动相溶解样品在溶剂选择的时候，应注意以下原则：--减少溶剂峰，尤其是不可使用组分峰靠近溶剂峰的流动相--保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在色谱柱中产生沉淀2.进样前一定使用0.45um的膜进行过滤如果样品很脏，要使用0.2um的膜进行过滤样品处理进样器自动进样器（SIL-10A/SIL-10Ai/SIL-10ADvp）手动进样器原理：（六通阀）注入方式：1）全量注入2）部分注入液相色谱基础知识手动进样器的原理图装填状态液相色谱基础知识进样状态交叉污染的原因

7、微量注射器红色表示残留样品手动进样法普通方法1.在进样状态下清洗针口2.在装填状态下插入微量注射器3.注入样品4.切到进样状态手动进样法便捷方法1.进样状态下插入微量注射器2.切到装填状态3.注入样品4.切回到进样状态柱温箱分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性液相色谱基础知识柱压低于150kgf/cm2柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃缓冲液PH使用范围为2～7ODS柱的使用注意点：硅胶在PH为3～4时稳定性最好碱浓度越低，流动相含水量越低，