分子生物学实验技巧

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1、限制性内切酶基础知识‹限制性内切酶·限制性内切酶基础知识·限制性内切酶关键注意事项·限制性内切酶疑难解决指南·限制性内切酶在基因组作图与分析中的应用如果没有限制性内切酶，当今的分子生物学研究会是个什么样子？40年来，限制性内切酶这个幕后成员默默推动着许多基础生物学研究和商业化应用。限制性内切酶（又称限制酶）首先是在细菌体内发现的，但后来在部分古细菌中也发现了这种成分。通常，限制性内切酶会切割双链DNA。每个限制性内切酶会识别特定的DNA序列，根据不同的内切酶类型，可在识别序列内或距识别序列不远的位置处切割DNA。识别序列长度通常为4-8b

2、p，酶切之后会形成粘性末端（5′或3′突出端）和平末端（图1）。图1.特定限制性内切酶切割后形成的粘性或平末端（5′或3′端）示意图。如今业内已经鉴定了大约4000种限制性内切酶，其中超过600种可商业化供应。REBASE是一个非常有用的资源库，可查询限制性内切酶全面信息及更新信息，包括限制性内切酶的特异性、灵敏度和商业化来源等 [1]。本页内容：·限制性内切酶发展史·许多克隆含有空载体·限制性内切酶分类·识别位点和酶切特异性·参考文献限制性内切酶发展史上世纪50年代初期，许多研究团队观测到了噬菌体对于同一物种的不同细菌宿主菌株存在感染效

3、率差异 [2,3]。Grasso和Paigen对此的描述如下：使用在一种细菌菌株（例如，大肠杆菌 C）内繁殖的噬菌体λ感染同一种类的另一菌株（例如，大肠杆菌K），结果发现，相比于重新感染宿主菌株（大肠杆菌C），大肠杆菌K的感染率出现明显下降。新的宿主（大肠杆菌K）似乎可以选择性抵御或“耐受”侵入的噬菌体。研究人员还发现，这一现象并没有遗传性，因为经过一轮感染后，在新菌株中生长的噬菌体还可以以正常的感染率感染该菌株。这种现象被称为“宿主控制变异”，有关其背后的机制也成为了频繁研究的领域 [4]。直到上世纪60年代，人们才发现宿主控制变异的机

4、制，其与噬菌体DNA的酶切有关，进而发现并分离出了限制性内切酶。上世纪60年代初WernerArber观测发现，宿主范围的决定性遗传物质都存在于噬菌体DNA之中，而后续实验证明甲硫氨酸参与宿主的自我保护[5]。这些发现最终催生了限制性修饰(R-M)体系的概念，通过该体系，来自于宿主的限制性内切酶和甲基化酶共同作用，切割外来病毒（非甲基化）DNA，同时保护宿主的DNA不受甲基化 [6]。颇为有趣的是，大多数R-M体系的早期研究工作围绕限制性内切酶的TypeI和TypeIII基团进行，该分类方法主要依据限制性内切酶的结构和功能（参见限制性内切

5、酶分类）。然而在KentWilcox和HamiltonSmith发现第一种TypeII级限制性内切酶HindII之前，限制性内切酶显然还未得到充分利用[7]。HindII能够识别特定的对称DNA序列，按照精确的方式切割识别序列内的位点。此功能（大多数早期TypeII限制性内切酶均发现存在此功能）促使KathleenDanna和DanielNathans使用HindII研究猿猴空泡病毒40DNA 物理图谱[8]，即所谓的限制性内切酶图谱。凭借在限制性内切酶方面的开创性研究，DanielNathans、HamiltonSmith和Werner

6、Arber共同获得1978诺贝尔生理学或医学奖。随着DNA连接酶的发现以及位点特异性限制性内切酶家族不断壮大，重组DNA技术应运而生。回到顶部限制性内切酶命名规则该命名规则综合考虑到内切酶来源的三种特性——属名、种名和菌株或血清型——组成了一个简短的名称，后面加上罗马数字，代表来自同一菌株的多个限制性内切酶 [9]。例如，HindIII酶（或者按照早期命名规则命名为 HindIII）代表：·“H”代表Haemophilus·“in”代表influenzae·“d”代表血清型d·“III”用于区分来自于Haemophilusinfluenz

7、a血清型d的其它限制性内切酶（例如，HindII和HindIII）。回到顶部限制性内切酶分类根据结构的复杂程度、识别序列、切割位点位置以及辅助因子要求，限制性内切酶分为四类。表1汇总了各类内切酶的区分特点表1.限制性内切酶类别和特性。内切酶类别特点TypeI·同时具有限制性和甲基化活性的多亚基蛋白·需要ATP·切割位点与识别位点间的间距不定TypeII·特异性的识别序列·切割位点位于识别序列内或邻近识别序列·在切割位点生成5′磷酸基和3′羟基末端·需要Mg2+TypeIII·由两个相反方向的识别序列组成·切割位点与其中一个识别序列的间距恒

8、定·需要ATPTypeIV·仅切割甲基化的DNA·切割位点大约距离识别位点30bp由于自身特殊的特点，TypeII限制性内切酶已经成为分子克隆、法医学DNA分析等许多研究应用最常用的限制性内切