mett11d1抗体的制备与鉴定

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1、METT11D1抗体的制备与鉴定作者：赵静,丁丽华,甘纯玑,李杰之,叶棋浓【摘要】　　目的:制备METT11D1(methyltransferase11domaincontaining1.简称其为GA9)（GenBank:AK024512）的多克隆抗体,并对其特异性进行鉴定。方法:融合表达GSTGA9（1228aa）和GSTGA9（229456aa）蛋白,利用包涵体纯化蛋白方法纯化蛋白,常规免疫小鼠,制备多克隆抗体。利用转染带有FLAG标签的FLAGGA9真核表达载体的293T细胞裂解物,Wes

2、ternblot检测抗体的特异性。结果:获得了GSTGA9（1228aa）和GSTGA9（229456aa）融合蛋白;利用这些融合蛋白得到的多克隆抗体可特异识别FLAGGA9蛋白。结论:成功得到可特异识别GA9的多克隆抗体,为进一步研究GA9的功能奠定了坚实的基础。【关键词】GA9;多克隆抗体　　在雌激素受体(estrogenreceptor,ER)的信号通路中,ER并不是单独发挥作用的,而是要与多种蛋白质发生相互作用,并受到这些蛋白质的影响,进而引起下游基因表达的变化,发挥其生物学功能,这是一

3、个动态平衡的过程。与ER结合的蛋白质被统称为ER共调节因子,当机体中的这些蛋白质发生异常表达时,就会通过与ER的相互作用导致下游基因表达的异常,8从而引起癌症的发生［1］。GA9可能就是这样一种蛋白,它是以ER作诱饵通过酵母双杂交从乳腺cDNA文库中钓取的基因,编码456个氨基酸（GenBankAK024512）。本实验中构建了GSTGA9（1228aa）和GSTGA9（229456aa）融合蛋白表达载体,从包涵体中纯化了GSTGA9(1228aa)和GSTGA9(229456aa)两种融

4、合蛋白,并将其免疫小鼠,获得可识别GA9蛋白的特异性抗体,为进一步研究GA9在乳腺癌中的功能提供了条件。　　1材料和方法　　1.1材料　　克隆载体pGEXKG、E.coliDH5α、FLAGGA9均为本实验室保存。293T细胞为本实验室保存,采用含100mL/L胎牛血清(江海生物工程有限公司)的DMEM培养基(Invitrogen公司)于37℃、50mL/LCO2培养箱内常规培养。转染试剂Vigofect购自威格拉斯公司。抗FLAG单克隆抗体(mAb)购自Sigma公司,HRP标记的羊抗鼠IgG购自Ve

5、ctor公司。限制性内切酶购自NEB公司,高保真pfuDNA聚合酶、T4DNA连接酶购自Promega公司,质粒提取试剂盒(包括小量提取和大量制备2种)购自Qiagen公司,DNA胶回收试剂盒及PCR产物回收试剂盒购自Promega公司。　　1.2方法8　　1.2.1重组质粒的构建　　分别以表1中所列的引物,以pcDNA3FLAGGA9为模板,PCR扩增GA9(1228aa)和GA9(229456aa)编码序列,双酶切PCR产物,将PCR产物分别插入到同样双酶切的pGEXKG载体中,即得重组质粒

6、。PCR扩增条件为:94℃变性1min后,按以下参数进行29次循环:94℃变性1min,55℃复性1min,72℃延伸2min,最后72℃延伸7min。PCR扩增所用酶为目前保真度最高的pfuDNA聚合酶。表1扩增GA9的引物及酶切位点（略）　　1.2.2GA9融合蛋白的表达鉴定　　将含pGEXKG空载体、pGSTGA9(1228aa)和pGSTGA9(229456aa)的DH5α以0.5％～1％转接到5mLLB培养基中,30℃培养到A=0.4～0.6时加入IPTG(0.5mmol/L),30℃培养

7、4～5h,收菌,进行考马斯亮蓝染色和Westernblot检测［2］。　　1.2.3多克隆抗体的制备　　将含pGSTGA9(1228aa)和pGSTGA9(229456aa)DH5α以0.5％～1％转接到培养瓶中,扩大培养,30℃8培养到A=0.4～0.6加入IPTG(0.5mmol/L),30℃培养4～5h,收菌,超声破碎,收集包涵体,利用尿素洗去杂蛋白。将纯化后的GSTGA9(1228aa)和GSTGA9(229456aa)包涵体蛋白与福氏完全佐剂1∶1混匀后,皮下多点注射BALB/c

8、小鼠,初次免疫后每2周加强免疫1次,末次免疫后第7天眼球取血,免疫血清于-70℃保存［2］。　　1.2.4哺乳动物细胞的转染　　用DMEM培养基(含100mL/LFBS)将293T细胞接种在6孔板中。接种后24h,将总量为5μgDNA与100μLNaCl混合,再将2μLVigofect与100μLNaCl混合,然后将上述两种溶液混合,室温放置20min,加入到细胞中,4h后换液。　　1.2.5Westernblot检测　　融合