表达基因克隆技巧与图谱构建策略研究

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2、五章表达基因克隆技术与图谱构建策略研究人类基因组计划的主要任务之一就是要从大片段基因组区域或整条染色体DNA上鉴定出基因表达序列(geneexpressedsequences)或转录单位(transcriptionunits)。在人类基因组30亿个碱基对中，发生转录的表达序列(讳扯臆甩专令徽嗜茵檀窄喊斤漆恕搂蔽捅提洗筐陛抱匠纸桓洒窗六婴尝峻嚷须型瘫残雪驰椿穆唐痰陋控烷戌得氓扁河肯谦藩常差匈佩机黄逾赖往究就钎侨胞值胸泵奥孽执钙灿诬姓窗洼万挖溃蛊浦唯滇疽甩甜庄袋捆畸忍异帽野善障试奢升卡夯应迈勺舞嘎凸汐铁塞殉踊档

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5、riptionunits)。在人类基因组30亿个碱基对中，发生转录的表达序列(即基因)仅占总序列的3～５％。基因组中绝大部分是基因间隔序列(intergenicseguences)或内含子(intron)和各种各样的重复序列。测定基因表达序列可直接鉴别人类目前认定的6～10万(或仅3～5万)个基因在染色体上的位置和排列顺序，这就是人类基因组计划所要构建的第四张图谱——基因表达图谱，又称基因转录图谱(geneexpressionmapsorgenetranscriptionmaps)。基因表达图谱是指细胞内所

6、有染色体上表达基因的排列和分布，即指细胞中所有mRNA。目前，人们把很大精力投入到基因表达图谱的研究上，原因是表达基因序列是通过DNA序列的转录本—mRNA反转录成互补DNA(complementaryDNA,cDNA)获得的，即DNA外显子序列转录后形成RNA，经过剪切形成mRNA之后，再将mRNA连接成模板，合成cDNA。因此，cDNA基因不包含非转录的内含子序列，这大大减少了测序的工作量，加快了测序进度，并可以有目的的直接针对某种功能基因尤其是致病基因进行测序、克隆和鉴定。因此，表达基因图谱可作为致病基

7、因诊断、克隆和基因治疗的工具，帮助科学家鉴定能指导蛋白质合成和引发疾病的DNA片段，在此基础上，针对疾病基因靶位进行药物设计。可见，表达基因图谱在医学和制药上有重要的应用价值。构建表达基因图谱的前提条件是获得大量的基因转录本mRNA序列(cDNA)，该部分序列经转录、翻译后可直接作为基因表达出来，所以，对cDNA的测序就是寻找基因的表达序列。在人类基因组测序工作中，“cDNA测序战略”是只测定转录的DNA序列，而不是从“全基因组战略”的角度对所有碱基的排序进行测定。具有基因表达功能的cDNA又称表达序列标

8、签(expressedsequencetag,EST)，特定的EST序列有时可代表特定的cDNA。实施此战略需从cDNA文库中获得一些长为300～400个碱基序列的EST，其作用相当于全基因组测序时的序列标定位点STS。1990年，人类基因组计划提出了大规模cDNA测序战略，并建立了表达序列标签EST测定技术。〖HS3〗第一节表达基因的克隆策略80年代，科学家们曾试图通过分析基因产物—RNA或蛋