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1、鸡马立克氏病的实验室诊断技术畜牧与饲料科学AnimalHusbandryandFeedScience2009,30(11—12):125—126鸡马立克氏病的实验室诊断技术孟玉学.杨为敏(河南省汝州市职业中专,河南汝州467500)摘要:检查鸡群感染马立克氏病病毒(MDV)情况对建立马立克氏病(marekSdisease,MD)诊断并无多大帮助,但对流行病学监测和病毒特性研究具有重要意义.主要对病毒分离,病毒鉴定,血清学诊断等马立克氏病的实验室诊断技术进行了阐述.以期为马立克氏病的流行病学监测和病毒特性研究提供参考
2、.关键词:马立克氏病;实验室诊断技术中图分类号:$858.315.3文献标识码:A文章顺序编号:1672—5190(2009)11-0125—02马立克氏病marekSdisease,MD)是最常见的一种鸡淋巴组织增生性传染病,以外周神经和包括虹膜,皮肤在内的各种器官和组织的单核性细胞浸润为特征.该病由一种疱疹病毒引起,传染性强,在病原学上与鸡的其他淋巴肿瘤病不同.马立克氏病病毒(MDV)分3个血清型:I型为致瘤的MDV:11型为不致瘤的MDV;m型为HVT.鸡是重要的自然宿主,除鹌鹑外,其他动物的自然感染没有实际
3、意义.但近年来报道.有些致病力很强的毒株可在火鸡造成较大损失.MDV广泛存在于自然界中,除SPF鸡群外,几乎所有的鸡场都不同程度的存在着MDV野毒株的流行.因此,在商业鸡群中病毒分离并不困难.但由于MD疫苗的广泛使用,特别是近年来MDVI型,Ⅱ型疫苗的使用,致使病毒分离作为临床诊断仅具有参考价值,同时该方法费时费力,临床诊断中很少采用,一般多用于以研究为目的试验中.1病料的采集在同一鸡群中,往往存在着不同毒力的MDV株流行,从表现MD症状鸡体内分离的病毒为致病性,而从无症状鸡体内分离到的病毒则可能是低毒力的或无毒力
4、的.从病原学诊断角度来看.只有从表现MD症状或病变的鸡中分离到的MDV才可能具有诊断意义.用于分离病毒的材料,可以采用病鸡的抗凝血或从抗凝血中分离的白细胞.也可以将病鸡的脾采用机械或胰蛋白酶消化的方法制备成细胞悬液,或采用鸡的羽髓浸出液.由于MDV具有高度的细胞结合性,在分离材料的处理过程中.除保持无菌条件外,还必须保持分离细胞的生理活性.2病毒分离病毒分离的方法主要有以下3种:2.1雏鸡接种将病料如病鸡的抗凝血等,经腹腔接种于1日龄无特定病原体(SPF)雏鸡,在隔离环境中饲养观察2个月,根据MD的剖检特征和发病率
5、情况进行判定.收稿日期:2009—11一l6作者简介:孟玉学(1970一),男,讲师,主要从事畜禽养殖教学和兽医临床诊断工作.2.2鸡胚接种将病料接种于4～5日龄的鸡胚卵黄囊内.接种后8～13d.在绒毛尿囊膜上可出现MDV引起的痘斑.在检查痘斑时应注意区别其他病原引起的类似痘斑.2.3细胞培养鸡肾细胞(CK)或鸭胚成纤维细胞(DEF)对于MDV的初代分离比较敏感.而鸡胚成纤维细胞(CEF)多用于病毒的传代.将病料如抗凝血中分离的白细胞或脾细胞按l0～10的接种剂量.接种于已形成单层CK或DEF细胞培养中,接种后24
6、h,洗掉接种物,同时更换培养液,继续培养至5～14d,即可观察到MDV引起的细胞病变.但有时需要进行1～2代盲传才能观察到细胞病变.如果从免疫鸡群中分离病毒,也可能分离到疫苗毒,有经验的操作者可以根据蚀斑出现的时间和形态,对3种不同血清型产生的蚀斑做出大体的判断.HVT的蚀斑出现比较早,而且比血清I型的大:血清Ⅱ型的蚀斑出现晚,比血清I型的小.但最终血清型的确定还需要用血清学特异性的单克隆抗体,PCR或致病性试验进行鉴定.3病毒鉴定3.1特异性单克隆抗体鉴定在3种血清型MDV之间,既存在着单克隆抗体可以识别的共同抗
7、原,也存在着单克隆抗体可以识别的血清型特异性抗原.将细胞分离的病毒进行蚀斑克隆.通过相应的单克隆抗体荧光检测,可以鉴定出分离物中MDV的血清型.该方法特异,准确,缺点是不能区别MDVI型的强毒株和疫苗株.3.2PCR鉴定方法在I型MDV的DNA中的长独特区(UL)和短独特区(US)之间存在着一段132bp的重复序列,其重复序列的多少似乎可以作为区别强毒株和弱毒株的标志.一般在MDV强毒株或vvMDVDNA中这段重复序列为2～3个.而弱毒株如CVI988或I型MDV人工致弱疫苗株的重复序列为9个左右.根据这一特征建立
8、的PCR检测方法,可以根据PCR产物的大小鉴别强弱毒.同时根据I型MDV和Ⅲ型MDV(HVT)的A抗原基因序列分别设计的特异性引物,可以用于I型MDV,Ⅱ型MDV,m型MDV之间的鉴别.将这些特异性引物配合使用.既可以用于MDV不同血清型养物中滴定,细胞的初始浓度为2xl05_3x10个/mL.每个稀[2]欧阳文军,秦卓明,周京昌.鸡传染性贫血病研究进展[J
