共培养模型.ppt.convertor

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1、肿瘤细胞与血管内皮细胞共培养模型的建立技术背景在肿瘤生长早期，实体肿瘤生长到1到2mm后，其继续生长就会依赖新生血管的形成。在此之前，肿瘤细胞本身已经释放了大量的促血管新生因子诱导肿瘤血管新生。这些新生血管是肿瘤和外界进行物质交换的基础，血管新生与恶性肿瘤的发展、侵袭和转移密切相关。因此，研究血管新生的机理研究，特别是早期的肿瘤血管新生，显得非常必要和迫切。建立肿瘤血管新生模型是研究其形成机制的重要手段。其中，体外共培养模型是模拟体内肿瘤血管新生的有效方法细胞共培养的概念及意义概念：体外细胞共培养（cellco-culture)：是将两种细胞（可以来自同一种组织，也可以来

2、自不同的组织）混合共同培养，从而使其中一种细胞的形态和功能稳定表达，并维持较长时间。意义：该技术能模拟体内生成的微环境,便于更好地观察细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互作用以及探讨药物的作用机制和可能作用的靶点,填补了单层细胞培养和整体动物实验的鸿沟。细胞共培养技术目前涉及的方面1.细胞与细胞之间的接触、作用,引起胞质膜的直接接触并产生细胞外基质ECM,其含有间质胶原、纤连蛋白、蛋白多糖及层粘连蛋白等成分,从而模拟了与体内相似的微环境,维持细胞的立体构形及促进细胞的功能2.细胞与细胞之间的相互作用,观察细胞共培养后其功能、性状和生长行为的变化,如某一细胞的分泌物对另外一

3、种细胞基因表达的影响,细胞与细胞之间的“对话”等3.研究药物对细胞形态、功能的影响以及相关机制,为新药研发提供重要技术支持我们现在所做的课题与后两项有关。常用细胞共培养方法：直接接触式共培养：在合适的条件下，将两种细胞按照一定比例在同一培养皿中共同培养。利用两种细胞或组织接触，通过旁分泌、自分泌分泌细胞因子或直接接触等相互作用方式缺点：两种细胞分离较困难，不便于观察和后续检测。直接接触式共培养非直接接触式共培养非直接接触式共培养：共培养体系中一者对另者的影响是通过旁分泌的细胞因子相互作用，但两者不接触。由于两种细胞容易分离，便于观察和不影响后续的检测。包括以下3种方法：（

4、1）用一种细胞的培养上清液（含有不同生长因子）与另外一种细胞共培养。（2）将玻片上（经过1型胶原凝胶预处理）培养的细胞B，以一定的比例放入细胞A的培养皿中与其共培养。（3）Millicell插入式细胞培养皿（Transwell小室）是一类有通透性的杯状装置,杯子底层放一张有通透性的膜,一般常用的是聚碳酸酯膜,孔径大小有0.1～12.0um.将Transwell小室放入培养板中,细胞A种在上室内,下层种植的细胞B其培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响三维细胞培养(threedimensionalcellculture,T

5、DCC)：TDCC是将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构,构成三维细胞载体复合物,如现在常用的基质胶(matrigel),是一种从小鼠肿瘤组织中提取的物质。在室温下，它形成类似于体内的细胞外基底膜的胶状结构，把内皮细胞培Matrigel胶内，内皮细胞表现出新生血管的特征。Matrigel胶方法的局限性是并不能很好模仿体内肿瘤和血管内皮的微环境，细胞分离及提取困难，而且细胞因子的弥散受到一定的影响。本实验选择：用一种细胞的培养上清液（含有不同生长因子）与另外一种细胞共培养。操作步骤：1.肿瘤条件培养基的

6、收集：取肿瘤细胞于DMEM培养液中常规培养（含10%胎牛血清和双抗），当细胞早期融合时，吸取肿瘤细胞上清液储存起来，并为细胞更换新的DMEM培养基。此后，每两天收集肿瘤细胞上清液一次。收集的条件培养基离心（2000rpm,10min)，并滤过（0.22um微孔膜）以除去漂浮的肿瘤细胞。该肿瘤条件培养基储存于-20度。使用前解冻离心。2.取人脐静脉内皮细胞制成单细胞悬液，接种于培养皿或N孔板内，贴壁培养12小时后吸去培养液，加入肿瘤条件培养液，继续培养。可根据实验需要决定换液时间。3.检测相关指标。参考实验一：CL联合苦参碱抑制胃癌细胞共培养内皮细胞增殖与凋亡肿瘤细胞培养液

7、刺激内皮细胞生长实验方法：取人胃癌细胞株SGC-7901于DMEM培养液中常规培养，吸取上清液，用DMEM培养液配成含7.25%,12.5%,25%,50%4个质量浓度的肿瘤上清培养液。当HUVEC细胞长成单层后,经胰酶消化制成单细胞悬液,接种于96孔培养板,100uL/孔，贴壁12小时,吸去培养液,加入上述4个质量浓度的肿瘤上清培养液100ul/孔，对照组加等量含10%血清的DMEM，继续培养48小时后,加MTT在酶标仪上测570处的值。本实验在同一条件下重复3次,取3次实验值的均数进行统计分析。确定肿瘤细胞培养液促进内皮细