分子细胞生物学复习资料

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1、分子细胞生物学1．分子细胞生物学的研究方法；2．近年来蛋白质和核酸的结构和功能研究进展；3．生物膜运输物质的分子机理；4．细胞各部位蛋白质的合成和定向运输的分子机理；5．细胞核的分子结构以及细胞核和细胞质之间物质运输的分子基础；6．细胞信号传导的分子机理。第一章分子细胞生物学学科简介和研究方法本章重点难点：分子水平上的操作技术。一、分子细胞生物学的研究对象和内容p1-2二、分子细胞生物学与其他学科的关系p1-2三、分子细胞生物学的研究方法-（一）、研究细胞的组成和结构1.荧光显微镜下鉴别细胞的组成和结构p2-4（1）免疫荧光法（2）活细胞研究（3）检测局部Ca2+浓度和细胞内的pH（4）共聚焦

2、扫描显微镜展示细胞内物质的立体分布2.在电子显微镜下鉴别细胞中的各种蛋白质的分布和超微结构p4利用抗体和抗原特异性结合的原理，电子致密度大的物质（金颗粒）作为标记，蛋白A起桥梁作用（蛋白A能同抗体Fc片段结合）。3．鉴定蛋白质的亚细胞定位或特殊细胞定位p5（1）将目标基因与标记基因（荧光蛋白基因GFP、RFP、YFP）融合，确定目标蛋白质的亚细胞定位（2）用目标基因的启动子驱动标记基因，确定目标蛋白质在不同细胞中的分布，时空表达特点等27（3）荧光显微镜或共聚焦扫描显微镜例如：GUS，葡糖醛酸酶，可催化化学反应，加入底物后有GUS表达的位置显蓝色。4.蛋白质亚细胞定位和超微结构定位的对比鉴定p

3、6标记蛋白miniSOG（小型单线痒制造者，有黄素蛋白、向光蛋白2等），表达后会发出绿色荧光，蓝光下miniSOG产生单线态氧可局部催化二氨基联苯胺（DAB）聚合形成嗜锇产物，嗜锇产物店子致密度高-电子显微镜下可见。5.检测大量元素和微量元素在细胞内的分布p6（1）用Na2S沉淀金属离子（2）用透射电子显微镜-能量散射广谱仪分析细胞营养元素的分布（二）、细胞的分离和细胞器的分离1.流向细胞分类器，荧光激活细胞分类器p7具体特点见ppt2.激光捕获微分离系统p7具体特点见ppt激光捕获显微切割即Lasercapturemicrodissection(LCM)technology是在不破坏组织结构

4、，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，成功地解决了组织中的细胞异质性问题，从而可以进行纯细胞的蛋白质组研究。其原理是用乙烯醋酸盐聚合体膜覆盖在被选择的细胞上，然后用红外激光熔化膜，这时膜与组织在目标位置牢固结合，当膜被提起时，仅目标细胞留在膜上，这些细胞直接在膜上进行裂解，再进行2DE分离及蛋白质组分析或用SELDIT0F进行分离与分析。此方法大大提高了随后分析(2DE，SELDI．TOF等)的重现性和准确性，是目前较为理想的细胞提取工具，已经用于膀胱癌、结肠癌等标本的准备3.细胞亚微结构的分级分离p7-8（1）差速离心法.（根据细胞亚微结

5、构的颗粒大小和密度差别，采用不同离心速度分离各种结构）（2）27密度梯度离心法（根据亚微结构的密度差别达到离心的目的，用蔗糖、甘油或氯化铯作为密度梯度的介质，高速离心机40000r/min，被分离物质分布在相应的密度带内）（1）激光剪（三）、生物大分子的操作1.放射性同位素是跟踪生物大分子活动必不可少的工具（1）放射自显影术（主要用于核酸）p8-9分类a：整体放射自显影（用肉眼观察，RFLP技术中，32p标记的DNA的放射自显影）b:体外培养细胞的放射自显影（借助显微镜观察，将细胞放在盖玻片上培养）c:显微（超微）放射自显影（借助显微镜或电子显微镜观察，含放射性同位素组织切片的放射自显影）感光

6、材料：X光胶片，液体乳胶（2）放射性同位素的定量测定p9-10种类：a：盖革计数器（常用于检测污染，特点见ppt）b:液闪计数器（特点和例子见ppt）（3）脉冲-跟踪技术p10-11（采用同位素跟踪技术研究生物大分子代谢活动的方法）基本步骤和研究实例见ppt2.确定核酸和蛋白质分子的大小以及分离和纯化核酸和蛋白质（1）电泳法p11（需要从凝胶中进一步分离大分子，分离效果好，分离量小）a．琼脂糖凝胶p11b.电泳脉冲电泳p11c.等点聚焦p12d.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳p12e.双向电泳p12f.PAGEp12脉冲场凝脉电泳(Pulsedfieldgelelectrophoresis，PFG

7、E)，是近年发展起来的一种重要的分离大分子量线性DNA分子的电泳技术。PFGE的基本原理是在琼脂糖凝胶上外加交变的脉冲电场，其方向、时间和电流大小交替改变，每当电场方向发生改变时，大分子DNA便滞留在凝胶孔内，直至沿新的电场轴重新定向后，才能继续向前泳动，DNA分子越大，这种重新定向需要的时间就越长，当DNA分子改变方向的时间小于脉冲时间时，DNA就可以按照其分子量大小分开，经EB染色后在凝胶上出