换个视角看世界——胡塞尔现象学

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燕连福2014.3换个视角看世界——胡塞尔的现象学 胡塞尔E.EdmundHusserl1859——1938，德国哲学家——1859.4.8诞生于奥匈帝国摩拉维亚(Moravia)的普罗斯尼兹(Prossnitz)的一个犹太家庭(今属捷克)。——1859年，极其不平常，达尔文《物种起源》发表，穆勒的《论自由》发表，美国哲学家杜威诞生，法国哲学家柏格森诞生。——胡塞尔是一个犹太人，摩西，马克思，爱因斯坦，弗洛伊德，斯宾诺莎。。。。。。——从小和寡居的母亲生活，形成带有女性特点的性格，受被他称之为精神父亲的老师布伦塔诺的影响，走上现象学的道路。最早研究数学，后研究哲学。希望使哲学像数学一样精确。 一、什么是现象学二、面向事物本身三、现象学的悬置四、换个视角看世界五、换个视角看自我六、换个视角看他人七、现象学的“构成”观 一、何为现象学：直觉的学问九方皋相马：秦朝的时候，有一个著名的相马大师伯乐。他晚年时候，给秦穆公推荐了九方皋相马。三个月后，九方皋回来报告说：“已经找到了，在沙丘那个地方。”穆公连忙问：“是什么样的马?”九方皋回答说："是黄色的母马。”穆公派人去把马牵来，却是黑色的公马。穆公很不高兴，把伯乐叫来说：“糟糕透了!你推荐找马的人，连马的颜色和雌雄都搞不清楚，又怎么能识别千里马呢?”伯乐感慨地赞叹说："九方皋相马竟达到了这种地步，这正是他之所以比我高明千万倍的原因呀。九方皋所看到的，那正是天机啊!他注重观察的是精神，而忽略了它的表象;注意它内在的品质，而忽视了它的颜色和雌雄;只看见了他所需要看的而忽视了他所不必要看的;只观察到他所需要观察的而忽视了他所不必要观察的。像他这样相出的马，才是比一般的好马更珍贵的千里马啊!” 1、何为现象一般而言，现象是指事物在发展过程中呈现给我们的外部形态。在柏拉图看来，现象是实在的不完整的、不完美的摹本。在笛卡尔看来，现象是令人遗憾的、甚至是虚假的东西。而在康德看来，我们只能认识现象，其背后的物自体我们是无法认识的。在黑格尔看来，现象是精神的外部表现，我们还需要进一步认识其本质。中国古代：现象即谓神、佛、菩萨等现身于人间。《西游记》第十一回：“五祖投胎，达摩现象。”三点评价：一是现象与其背后的东西是二元对立的。二是我们靠感官获得现象。三是现象在价值上是低于本质、实在、内在的东西的。 2、胡塞尔的现象在胡塞尔看来：现象不是事物外部的表现，而是事物本质的呈现；不是通过感官得到的，而是通过直觉得到的；不是虚假的东西，而恰恰是最真实的东西。现象，就是“显现自身的东西”，是事物呈现给人的、人通过意识直觉到的东西。所以，现象和本质是一回事，现象就是事物的本质；现象是完善的、真实的、具有重要价值的。 3、现象学：直觉主义的学说方法论：分析方法、辩证法、整体（结构）、直觉。唯有直觉直接经验到的东西是可靠的。而通过间接经验到的东西是不可靠的。所以，现象学是一种以直觉的方式、直接体验事物本质的学说。（九方皋相马，就是一种现象学的方法。）“因此，现象学是关于普遍意义上的体验的理论，包括所有在体验中被给予的并可在体验中被明白发现的东西，不管它是实在的还是意向。”——胡塞尔《逻辑研究》第二卷，芬德雷英译，1970，862。 二、面向事物本身：哲学研究的开端1、胡塞尔：寻找明证性的开端。以往哲学最大的问题：缺乏明证性。哲学史：缺乏无可置疑的开端和起点。没有明证性，如重病染身。寻找“无任何先决前提的前提”。Presupposition：预设。毫无疑问，直接。Presumption：假定。找一个东西考虑为真理，需进一步论证。Premise：认定为是前提的东西，不一定真或假。“只有穷人才觉得高铁票价高……”阿基米德点，知识的考古学，哲学的起步者。 2、胡塞尔：语言是哲学的开端吗？语言哲学异军突起：超出心物，另寻路径。坚持“工欲善其事，必先利其器”，哲学研究须始于语言。穆勒《逻辑学》中写道：“语言无疑是人类思维最重要的工具。语言就像望远镜一样，只有工具的完善，才能看到最真实的东西”。现代语言学家：“全部哲学是语言的批判”。语言的误用导致哲学的各种问题。哲学家的任务：学会分析和使用语言。胡塞尔的批判：语言固然重要，但语言不等于意义本身。所以，我们要研究意义本身。 3、哲学的开端：回到事物/现象本身事物本身：“在直接经验中对意识呈现者”，即“直觉”的经验物，是胡塞尔所说的现象。回到事物本身，必须靠直觉，那么，什么是直觉呢？——Intution:一般指心灵无需感觉之助，无需先行推理或讨论，就能看见或直接领悟真理的天生能力，是通过瞬间的洞察对普遍中的特殊事物的认知，是对那些无法言表的东西的直接把握。第一，直觉是认识不可借贷的硬通货。只有直觉才能保证认识对象的明证性。一切原则的原则，真正的实证主义者。第二，直觉并不等同于经验论的感觉。第三，直觉具有构成功能，直觉可以激活它的对象。 例如：数学中“两点之间直线距离最短”、伦理学中“善”的概念、美学中对美的欣赏是靠直觉。如何有直觉能力：——超功利：康德讲“为把握美，要无目的，非功利，抛弃功利取舍才能进入美。”——有距离：布洛讲“进入美的体验，需要与审美对象拉开距离，不能发生存在上的联系，无视审美对象本身的存在。只有距离才产生美。”——忘现实：要想欣赏波涛汹涌的波浪，就要忘记船只被波浪吞掉的危险；要欣赏模特的美，就要摆脱肉欲的困扰才行。老子讲：为学日益，为道日损。也是这个道理。 三、现象学的悬置：回到纯粹意识如何回到事物本身？用现象学的悬置。看世界的四种方法：1、自然观点（一般人的常识）第一，相信外部世界是有的。“我意识到一个在空间中无穷延伸，在时间中无穷发生着和发生了的世界。。。。（它们）存在着，无论我是否由考虑、思索、感觉、欲望它们而特别注意它们。”第二，这个世界对我作为事实世界，而且作为价值世界、善的世界、实用的世界而有的。第三，从时间上讲，这个世界对我而言是连续存在的。第四，从空间上讲，这个世界是一个主体间的世界。即，这个世界对一切人存在。 2、古希腊人的惊奇：哲学始于惊奇正如常识满足于习以为常一样，古希腊人认为，哲学始于惊奇。它惊奇世界为什么是这样而不是那样？惊奇“可能”本身又如何可能？惊奇使哲学家以一种更加童真的眼光看待世界，使一切人们习以为常熟视无睹的东西存疑待审，蓦然回首向一片新的神奇领地。3、笛卡尔的怀疑：普遍怀疑一切“要想追求真理，我们必须在一生中尽可能地把所有的事物都来怀疑一次。”只有普遍怀疑，才能使最终不可被怀疑的东西即绝对真理得以呈露。 4、胡塞尔：现象学的悬置。悬置，是一个希腊术语，其意思是指“加括号”，即中止判断或不予考虑。所谓现象学的悬置，是指把一切先入之见放进括号中不予考虑。第一，是对自然观点的悬置。——胡塞尔的悬置不等于笛卡尔的怀疑。怀疑具有否定的意味，而悬置并不导致否定，仅仅是“存而不论”。——悬置并不是随心所欲地把“正题变成反题，把肯定变成否定”，而是使它失去作用，我们“不去使用”它。——不同于贝克莱的“存在就是被感知”，不是主观唯心主义，仅仅是“中止不考虑”而已。 第二，是对科学方法的悬置。对自然观点的悬置也必须意味着把一切与现存世界有关的科学统统放进括号失去作用。“我绝对地不运用他们的标准。”第三，是对形而上学的悬置。有点类似于道家那种“离形去智，超然象外”，但不同于佛教的说的“跳出三界，想入非非”，不同于传统形而上学的“背离经验，玄思冥想”。总之，悬置目标：为科学寻求一种没有任何先入之见和超验之物的纯粹的本原客体。因此，其又被称为“现象学还原”。 5、回到纯粹意识领域——悬置之后，如果从对象的角度看，剩下的是原始予料。如果从意识的角度看，剩下的是纯粹意识。但是在胡塞尔这里，二者完全是等同的。两者是中性概念，我们不应以传统的主体、客体的概念来理解它们。——最后达到纯粹的体验状态：不是庄子的物我两忘、万物齐一的状态不是康德的现象和物自体两分、物自体不可知的世界 纯粹体验状态：颜回曰：“回益矣。”仲尼曰：“何谓也？”曰：“回忘仁义矣。”曰：“可矣，犹未也。”他日复见，曰：“回益矣。”曰：“何谓也？”曰：“回忘礼乐矣！”曰：“可矣，犹未也。”他日复见，曰：“回益矣！”曰：“何谓也？”曰：“回坐忘矣。”仲尼蹴然曰：“何谓坐忘？”颜回曰：“堕肢体，黜聪明，离形去知，同于大通，此谓坐忘。” 四、换个视角看世界：回到意向性1、意识的基本特征是意向性。即意识总是关于某物的意识。如：“我们不可能简单的、空洞地说我感觉、我想象、我判断、我高兴、或者我爱我憎，而必须涉及到我经验活动中我与之发生关系的那种东西，必须言有所指地说：我感觉某物、我想象某物、我判断某物、我高兴某物、我爱或憎某物”。因此，意识都是指向对象、关于对象的意识。意识不是一种不假外求自我满足的封闭系统，而是一种汲汲外求对世界开放的关联领域。 2、意向性是一种反思活动传统认识论以正思（知觉）为其认识论出发点，而现象学则坚持向“反思”的转移。胡认为，反思reflection，“是对看向X的原始的直接的方向的背离”。其不是一种外向地看向空间物的知觉，而是一种内向地看向纯粹意识本质的沉思。作为人的两种认识职能，正思（知觉）和反思都具有重要的地位。正如知觉是从事经验和事实科学的唯一途径一样，唯有反思才是通向哲学殿堂的不二法门。 反思表明：认识主体与认识客体不是一种感官的感知关系，而是一种意向的指向关系；认识客体或认识对象也不是什么感知的某物，而是一种意向的相关活动；在意向活动中，相关所予对象不再外在于空间位置里，而是内化于纯粹意识的意向流里。对于这种对象，我们无须向外探求、通过外知觉即空间意识来透视，而只须反求诸己，通过内知觉即时间意识来直观。 指向反思表明：认识主体客观事物认识客体感知呈现意向流 3、意向结构的两个概念其一，以意向行为noesis与意向对象noema取代传统认识论中诸如主体和客体，认识活动和认识对象等二元论倾向的概念。表明：所予对象不是在意识中被给予，而是在意向行为中被构成；所予对象不是一种即成的予料，而是一种构成的产品。其二，被给予与被构成成为同一种东西。例如：“一块矿石，由物理学家来看时它就会成为一种物理对象，由艺术家来看是就会成为一种审美对象，而由经济学家来看时它就成为一种价值对象。再如，我们还可以以感觉、表象、判断、期待、怀疑等不同的意识方式看这块矿石，随着我们看的方式不断改变，这块矿石就会随之成为感觉的对象、表象的对象、判断的对象、期待的对象、怀疑的对象等不同的对象”。 4、换个视角看世界：现象的世界（1）世界不再是作为“自在之物”的自在的世界，而是作为“为我之物”的为我的世界。“万物皆备于我。”“君未看花时，花与君同寂；君来看花日，花色一时明。”“花自飘零水自流,一种相思,两处闲愁。此情无计可消除,才下眉头,却上心头。” （2）世界不再是冰冷的物理世界，而是具有温度的“主客合一”的世界。唯物主义的世界是物质世界，唯心主义的世界是精神世界，现象学的世界既有物质的世界，也有精神的世界。人们既会为“感动中国”的现实人物叫好，也会为“来自星星的你”悲喜交加。苏轼(宋）若言琴上有琴声，放在匣中何不鸣？若言声在指头上，何不于君指上听？ （3）世界不再是灰色的单一世界，而是具有色彩的缤纷的世界。理性主义眼中的世界，是单一的，而现象学的世界，是具有多幅面孔的。物理学家眼中的水是液体、化学家眼中的水是H2O1,老子眼中的水是“上善若水”，孔子眼中的水，是“逝者如斯夫”，李白眼中的水，则是“飞流直下三千尺，疑是银河落九天”。 这说明：西方哲学从“传统认识论的实体说的心物二元论”走向“现象学的构成说的意向经验的一元论”。 五、换个视角看自我：回到先验自我现象学的悬置，最后只有“先验自我”不能被悬置，是最自明的东西。1、对这种起点的质疑：一种所谓的最终前提和起点，即等于一种自身没有前提的前提和自身没有起点的起点，这在逻辑上是完全不可能的。它会像无源之水，无本之木一样完全是一派胡言。也就是说，我们为什么可以悬置一切，而唯独不能悬置先验自我？这种对不可悬置的先验自我的假定，难道不也是一种先入之见吗？ 2、回答：经验先于逻辑先验自我的终极性质的确定，并不依助于逻辑的推论，而是直接经验即直觉把握的结果。A，在直接经验中，我们不是假定了、推论出了我，而是确确实实的经验了我。B，即使我怀疑我的存在，但是这仍是由我这个存在者来怀疑。C，即使我被一个全能者所欺骗，但是为了被欺骗我也必须存在。因此，我的明证性是不假外求的，是绝对自给的。D、任何企图对我作出进一步说明的努力，都会像中国禅宗所说的“骑牛觅牛”一样而徒劳无功。我是照相机的眼睛，它注视着，但是永远不能拍下它自身。 3、胡塞尔的自我与笛卡尔的自我的区别笛卡尔的的我思胡塞尔的先验自我方法数学的方法经验的方法性质实体性的功能性的一元二元二元论：我之外还有世界一元论：世界彻底统一于先验自我单复数单数的复数的我们 4、真理约定论四种真理观：其一，真理符合论：命题符合存在情况。其二，真理冗余论：“真的”这一谓词多余。“P是真的”等于说“P”。“草是绿的”为真=草是绿的所以，真的或假的，只是在修辞和风格上起作用的谓词。其三，真理实用论/工具论以实用主义为代表，认为有用即真理，工具即真理，实用即真理。其四，真理约定论真理是人类的约定而不是独立的实在或必然性。是人们塑造了真理。欧几里德几何学与非欧几何学的不同，不是事实的不同，而是约定的不同。费耶阿本德：怎么都行。库恩：科学范式的革命。 六、换个视角看他人我如何证明他人的存在？——萨特：他人即地狱——康德：哲学到现在仍然证明不了他人的存在，这是哲学的耻辱。——孟子：敬人者，人恒敬之；爱人者，人恒爱之。 胡塞尔构成他人的三步法：1、联想：对他人的、异己的身体构成对他人身体的构成，既不是通过感性知觉来构成，也不是通过理性演绎来构成，而是通过一种自由想象的“联想”来进行的。正是通过这种联想，他人的物理的身体的显现方式使我回忆起我自己的身体的显现方式，即“如果我在那里的话，我的身体会是什么样的”，从而使他人的“那儿”成为我的“这儿”。因此，联想就是对他人的物理的身体的生命的“激活”和“唤醒”。 胡塞尔构成他人的三步法：2、移情：对他人的心灵的构成正如我的身体内在具有心灵一样，他人的身体里必然有一同样的心灵。这就导致“移情”的出现。这种移情可以使我由此及彼地推心置腹于他人。“我可以根据在类似处境下我的自己的行为举止而很容易理解某个愤怒或快乐的人的行为举止”，进而领悟以人同此心，心同此理，他人的心灵与我的心灵是完全一致的。——这也可以解释情绪的传染性 胡塞尔构成他人的三步法：3、主体间性：对于客观世界的主体间的构成通过先验的移情对另一个自我的揭示必然导致两种可能：一方面，由于他人对我来说本来是异己的，那么他人所意向地构成的世界对于我来说也是异己。另一方面，既然他人和我在身体和心灵上同类的，那么，他人所意向的构成的世界与我所意向的构成的世界必然是同一个世界。这种一致性并不意味着他人的世界从属于我的世界，而是说该世界是“我们”共同构成的世界，是一个“主体间”的世界。 七、现象学的构成观使我们的认识：1、使我们认识论的兴趣重心从客体转向主体。其一，从非我转向我，是我激活了非我，是我赋予非我以意义。其二，我已经不是再是空虚地看，一种器量狭小的知识的容器，我毋宁说已经成普照万物、赋予万物以生机的太阳，成为非我意义之发源地。其三，人不仅可以为自然界立法，而可以为自然界立身；人已经成为自然界真正的生命形式，而自然界则是这一生命形式的具体体现。人本主义与自然主义的合二为一的梦想，终于姗姗来迟地在现象学的王国里如愿以偿。 2、从实在论转向功能论。其一，传统哲学家始终津津乐道于谈论实在的话题，如泰勒斯、德谟克利特、柏拉图。其崇尚实体就像商人崇尚黄金一样，成为长久不息的哲学时尚。而现象学表明：一切对象都不是实在的物体，而是一种绝对透明的意向活动，实体不过是自然主义哲学家的奢侈品。从而转向对功能的讨论。其二，这种功能不是那种经验自我的感受能力的心理功能，而是先验自我普遍活动，是具有指向、联结、整合、构成客体的作用，具有一定方向性和目的性的控制论系统。其三，其是能动和受动的统一体。哲学上功能主义和物理上的功能主义在今天已经遥相呼应。 3、从现实性走向可能性。在意向经验构成的过程中，必须有一边缘域，即可能经验的领域。如我们以意向的方式看一所房子时，焦点所在即为前景，没有看到的即为背景，但随着视线转移，背景不断变为前景。具有“不断展开的无限性”，潜在的经验具有潜在的意义。胡塞尔认为，可能性的知识必须优先于现实性的知识，这是一个真正伟大的真理。是对传统潜能说的深化，是对构成活动中动力学意义的彰显。 4、从空间性走向时间性。空间性是知觉经验的本质形式，那么，时间性则是意向经验的本质形式，这种时间是一种现象学的时间，而不是一种客观的宇宙的时间。宇宙的时间：即一种和外部的物理事件相关的时间，借助于空间物才可把握和测量的空间化的时间，即超验的时间。现象学的时间：则是和我们内在的经验有关的时间，是一种内在的时间；它是一种自给自足的绝对的时间，不可能借助空间物来把握和测量，但可以被纯粹意识所直觉。通过直觉我们发现它有三个界限：以前、现在和以后。所以，真实的东西并不是什么实实在在的事物，而是川流不息的过程。 阅读书目：胡塞尔：《纯粹现象学与现象学哲学的观念》 敬请批评指正! 本文观看结束！！！ 谢谢欣赏！ 5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2mRNA表达的影响 5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2mRNA表达的影响作者：杜雅冰，邵应举，樊青霞，孙桢，王琳，赵培荣作者单位：(郑州大学第一附属医院肿瘤内科，河南郑州450002)【摘要】目的探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)干预对食管鳞癌细胞株Eca9706生长增殖及其组织因子途径抑制物2(tissuefactorpathwayinhibitor-2，TFPI-2)基因表达的影响。方法选取食管鳞癌细胞株Eca9706，并用不同浓度的5-Aza-CdR处理该细胞株。MTT法检测干预前后细胞增长率的变化，FCM法检测干预前后细胞凋亡率的变化，RT-PCR技术检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2基因mRNA的表达，免疫组化检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2蛋白的表达。结果　食管鳞癌细胞株Eca9706存在TFPI-2基因超甲基化状态，经5-Aza-CdR处理后，超甲基化状态解除，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡率明显提高(P<0.05);细胞中TFPI-2蛋白表达明显增强，同时mRNA的表达水平也较处理前明显提高(P<0.05)。结论　食管癌细胞系TFPI-2基因超甲基化可抑制其mRNA表达，当其超甲基化解除后，细胞增殖受到抑制，同时细胞凋亡率相应提高。 【关键词】食管癌;组织因子途径抑制物-2;5-氮杂-2-脱氧胞苷;甲基化;免疫组化;逆转录聚合酶链反应;凋亡ABSTRACT：ObjectiveToexploretheeffectsof5-Aza-2-deoxycytidine(5-Aza-CdR)interventiononthegrowthandproliferationofEca9706celllineandproteinexpressionoftissuefactorpathwayinhibitor-2(TFPI-2).MethodsEca9706celllinewastreatedby5-azaCdRofdifferentconcentrations;MTT，flowcytometry，immunohistochemistryandRT-PCRwereusedtodeterminethecellgrowth，apoptosis，andtheexpressionofTFPI-2geneanditsprotein.ResultsEca9706celllinehadhypermethylationofTFPI-2.Afterdemethylationby5-Aza-CdRtreatment，theproliferationofEca9706wasinhibited，theapoptosisratewasalsoincreasedsignificantlyintheconcentration-dependentmanner.RT-PCRdetectedthatmRNAexpressionofTFPI-2geneinEca9706celllinerecoveredsignificantly(P<0.05).Conclusion5-Aza-CdRcanslowthegrowthofEca9706cell，increasetheapoptosisrate，reactivatetheTFPI-2genetranscriptionandproteinexpressionbydemethylation.KEYWORDS：esophagealcarcinoma;tissuefactorpathwayinhibitor-2;5-Aza-CdR;methylation;immunohistochemistry;RT-PCR;apoptosis 组织因子途径移植物2(tissuefactorpathwayinhibitor，TFPI-2)是丝氨酸蛋白酶抑制物，在调控肿瘤细胞浸润转移方面起着重要作用。目前，关于TFPI-2在食管癌中的基因表达情况的分析研究尚少。本研究旨在探讨TFPI-2基因的失活机制，并寻找食管癌治疗的新靶点。1材料与方法1.1材料RPMI-1640培养基购自北京索莱宝生物科技有限公司;标准胎牛血清购自天津市灏洋生物制品科技有限公司;Trizol试剂购自MBI公司;RT-PCR试剂盒购自MBI公司;5-Aza-CdR购自Sigma公司;人食管癌细胞株Eca9706由郑州大学肿瘤生物学研究室惠赠。1.2细胞培养和药物处理人食管癌细胞Eca9706以含10mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养基，37℃、50mL/LCO2培养箱培养，每2～3d消化传代1次。1.3MTT法检测干预前后细胞增长率的变化取对数生长期细胞，调整密度至5×104/mL接种于96孔板，按5-Aza-CdR浓度分为6组：0、0.4、1.6、6.4、25.6、102.4μmol/L，每组复设5个孔。待细胞贴壁后，分别于24、48、72h后加入MTT液，4h后弃去上清液，每孔加DMSO150μL，在490nm波长测定各孔吸光度值(absorbance，A)。细胞增殖抑制率(cellularproliferationinhibitionrate，CPIR)按公式计算：CPIR=(1-实验组A均值/对照组A均值)×100%。 1.4流式细胞仪(FCM)检测干预前后细胞凋亡率的变化取对数生长期细胞，按5×105/mL的密度接种于6孔板内，待细胞贴壁后加药，分组如下：对照组(0μmol/L),1.6μmol/L5-Aza-CdR组，25.6μmol/L5-Aza-CdR组，102.4μmol/L5-Aza-CdR组。每组均于5-Aza-CdR作用48h后消化收集细胞，700mL/L冰乙醇固定，流式细胞仪进行细胞凋亡测定。1.5RT-PCR技术检测TFPI-2基因mRNA的表达分组同FCM，每组细胞均5-Aza-CdR作用48h。TFPI-2的上、下游引物分别为5′-GTCGATTCTGCTGTTTTCC-3′和5′-ATGGAATTTTCTTTGGTGCG-3′，合成产物为440bp;β-actin作为内参照，上下游引物分别为5′-AGGCATTGTGATGGACTCCG-3′和5′-AGTGATGACCTGGCCGTCAG-3′，合成产物为301bp。按照试剂盒说明书，用Trizol试剂提取细胞总RNA，经紫外分光光度计分析后，按Sigma公司RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit说明书操作。先逆转录制备单链cDNA，再以逆转录产物为模板，用上、下游产物进行PCR反应扩增目的基因。反应条件为：94℃预变性3min，然后94℃变性30s,51℃退火30s,72℃延伸30s，循环30次，最后72℃延伸5min,4℃保温。扩增片段经20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1.6免疫组化方法检测TFPI-2蛋白的表达取对数生长期细胞，按5×104/mL的密度接种于经预处理的盖玻片上，待细胞贴壁后加药(分组同RT-PCR)。培养48h后加入40g/L多聚甲醛溶液固定30min,30mL/LH2O2封闭内源性过氧化物酶，室温下10min,100mL/L动物血清封闭，室温下10min，滴加1∶100的稀释的TFPI-2抗体4℃过夜，二抗室温下1h，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育30min，DAB显色，苏木精复染，脱水透明封片。另取爬片滴加PBS液代替一抗作为阴性对照。结果判定：TFPI-2蛋白阳性信号均呈棕黄色颗粒样物质，位于细胞质内。光镜下随机选取10个视野(每个视野观察细胞数不少于100个)，按阳性细胞所占百分比进行结果判定。阳性率=(阳性细胞数/1000)×100%。1.7统计学处理应用SPSS16.0软件进行统计学处理。实验数据采用均数±标准差(x-±s)表示，采用单因素方差分析加LSD两两比较法进行分析。检验水准α=0.05。2结　　果2.1干预前后细胞增长率的变化经MTT检测，结果显示，实验组细胞抑制率明显高于未加药组，且随着作用时间的延长和浓度的增加而增加(表1)。表1不同浓度的5-aza-CdR对Eca9706细胞增殖的影响 2.2干预前后细胞凋亡率的变化流式细胞仪分析可见，经不同浓度5-Aza-CdR诱导48h后，Eca9706细胞各处理组凋亡率分别为(13.76±0.47)%、(26.97±0.39)%、(41.03±0.19)%，与5-Aza-CdR诱导浓度成正比。与对照组[(1.39±0.27)%]比较差异有统计学意义(P<0.05)，且各浓度组间比较差异亦有统计学意义(P<0.05，图1)。以上实验重复5次。2.3干预前后Eca9706细胞mRNA的表达情况扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，Eca9706细胞中TFPI-2mRNA表达在各用药组和未用药组之间有明显差异，TFPI-2mRNA在未用药组细胞中未见表达。经1.6、25.6、102.4μmol/L5-Aza-CdR处理后可见TFPI-2mRNA表达，表明在一定范围内随5-Aza-CdR药物浓度的增加TFPI-2mRNA表达逐渐增强(图2)。图1各组流式细胞凋亡散点图A：对照组;B：1.6μmol/L5-Aza-CdR组;C：25.6μmol/L5-Aza-CdR组;D：102.4μmol/L5-Aza-CdR组。图25-Aza-CdR处理前后Eca9706细胞TFPI-2mRNA的表达M：DNAmarker;β-actin：301bp;TFPI-2：440bp;1：对照组;2：102.4μmol/L组;3：25.6μmol/L组;4：1.6μmol/L组;5：H2O对照组。,2.4干预前后TFPI-2蛋白的表达情况　免疫组化结果显示，经5-Aza-CdR作用Eca9706细胞48h， TFPI-2蛋白的阳性表达率增加，对照组、1.6μmol/L组、25.6μmol/L组、102.4μmol/L组TFPI-2蛋白的阳性表达率分别为(2.10±1.42)%、(9.31±2.70)%、(14.72±3.50)%、(68.20±3.20)%，不同浓度组之间以及用药组与对照组之间的差异均有统计学意义(P<0.05，图3)。　图3各组TFPI-2蛋白的表达情况3讨　　论人TFPI-2(hTFPI-2)基因定位于7q22区域，全长由8164个碱基组成，其cDNA全长为1222kb。其mRNA的启动子具有典型的管家基因特征，没有典型的TATA盒或CAAT盒，在推定的转录起始位点区域GC含量超过80%[1]。TFPI-2可在体内多种组织广泛表达，在这些组织内一旦出现肿瘤，TFPI-2的表达水平也会随之显著下降[2]。有研究证实，在绒毛膜癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质细胞瘤、纤维肉瘤和胸部恶性肿瘤组织中，与肿瘤产生相关的TFPI-2表达水平减少可能与其启动子的甲基化密切相关[1,3-5]。启动子区cpG岛高甲基化在肿瘤形成机制中的确切作用尚不清楚，然而众多证据表明，肿瘤抑癌基因CpG岛异常的甲基化导致基因失活和转录抑制是肿瘤发生的重要机制之一[6-8]。 目前，有体外实验表明，DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR通过去甲基化作用可使多种含有CpG岛的高甲基化抑癌基因重新表达，从而恢复抑癌功能[9]。本实验RT-PCR结果显示，TFPI-2在Eca9706细胞中无表达，经过不同浓度的5-Aza-CdR处理Eca9706细胞后，TFPI-2亦重新出现表达，且在一定范围内随药物诱导浓度的增大表达逐渐增强。MIZUNO等[10]研究表明，肿瘤细胞中DNMT的表达较正常的高4～12倍，也证实DNMT上调参与肿瘤发生。这与我们的实验结果一致。根据MTT实验可知，经过5-Aza-CdR干预处理过的Eca9706细胞增殖明显受抑制，且随着药物浓度的增加，抑制作用越明显。从本实验结果分析，DNA启动子区去甲基化能较明显地抑制食管癌细胞增殖，并与其诱导剂量呈正相关，推测这种抑制作用与去甲基化后重新激活TFPI-2基因的转录和表达有着直接关系;此外可能与去甲基化后诱导细胞凋亡有关。进而通过流式细胞仪分析，结果显示，经不同浓度5-Aza-CdR干预的Eca9706的细胞中，用药组与对照组相比细胞凋亡率凋亡率有所增加，并且与5-Aza-CdR诱导剂量有依赖性关系。BENDER等[11]在同等条件下用5-Aza-CdR处理恶性肿瘤细胞系和正常纤维细胞系时，发现肿瘤细胞增殖均被抑制，而纤维细胞增殖不被抑制。因此，5-Aza-CdR对Eca9706细胞增殖的抑制及凋亡的增加不是药物的毒性影响，可能是因为使TFPI-2重新表达的结果。 目前，国外以TFPI-2为药物研究靶点，就TFPI-2在肿瘤治疗、肿瘤临床诊断、促进伤口愈合和动脉粥样硬化治疗等领域中的应用，也正在进行广泛深入的研究。本研究用甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理人食管癌Eca9706细胞株，检测TFPI-2基因表达的变化及其对细胞增殖和凋亡的影响，以期寻找治疗肿瘤的新靶点。【参考文献】[1]HUBEF，REBERDIAUP，IOCHMANNS，etal.CharacterizationandfunctionalanalysisofTFPI-2genepromoterinahumanchoriocarcinomacellline[J].ThrombRes，203，109(4)：207-215.[2]MIYAGIiY，KOSHIKAWAN，YASUMITSUH，etal.cDNAcloningandmRNAexpressionofaserineprotein5andtissuefactorpathwayinhibitor-2[J].JBiochem，1994，116(5)：939-942.[3]RAOCN，SEGAWAT，NAVARIJR，etal.MethylationofTFPI-2geneisnotthesolecauseofitssilencing[J].IntJOncol，2003，22(4)：843-848.[4]KONDURISD，SRIVENUGOPALKS，YANAMANDRAN，etal.Promotermethylandsilencingofthetissuefactorpathwayinhibitor-2(TFPI-2)，ageneencodinganinhibitorofmatrixmetalloproteinasesinhumangliomacells[J].Oncogene，2003，22(29)：4509-416. 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