蔗糖合成酶的测定方法

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1、蔗糖合成酶的测定方法一、仪器设备冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计二、试剂HEPES-NaOH（50mmol/L，pH7.5）缓冲液，包括50mmol/LMgCI2；2mmol/LEDTA；0.2%(W/V)BSA；2%PVP；0.1%间苯二酚：称取0.1g溶解并定溶于100ml95%乙醇中。30%盐酸、2mol/LNaOH、100mmol/LUDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖三、操作方法1、粗酶液制备称取0.5g样品（植物叶片去掉主叶脉），洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3mlHepes-NaOH缓冲液，冰浴研磨，10000

2、×g离心10min。2、酶活性测定依次加入50μL粗酶液，50μLHepes-NaOH缓冲液pH7.5，20μL50mmol/LMgCI2，20μL100mmol/LUDPG，20μL100mmol/L6-磷酸果糖（20μL100mmol/L果糖），30℃中反应30min后，加入200μL2mol/LNaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml30%盐酸和0.5ml0.1%间苯二酚，摇匀后置于80℃水浴保温10min，冷却后置于480nm处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。同时取50μL粗酶液，加入200μL2mol/LNaOH

3、，以下同上操作，测定蔗糖含量。3、蔗糖标线制作：取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。4、计算样品中酶活性（μg·g﹣1·h﹣1）=式中C—反应液催化产生的蔗糖总量（μg）；V1—提取酶液时加入的缓冲液体积（ml）；V2—酶反应时加入的粗酶液体积（ml）淀粉酶活性的测定1方法1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液：0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH5.6);1%的淀粉溶液：用0.1mol/L-1的柠檬酸缓冲液(pH5.6)配制；标准麦芽糖溶液(1mg/mL-1);3,

4、5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):称取6.5g3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000mL容量瓶中，加入325mL2mol·L-1NaOH溶液，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000mL。淀粉和麦芽糖为Sigma产品，其余试剂为国产分析纯试剂。1.2测定方法1.2.1酶液的提取将每一个重复的3个果实去皮后切碎混匀，称取其果肉1g，置于预冷的研钵中，加2mL预冷的0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH5.6)和少量石英砂研磨，将匀浆移入7mL的离心管中，再分别用1mL的0.1mol/L-1柠檬酸缓冲(pH5.6)冲洗2次,于4℃下以1500

5、0×g离心15min，上清液转移入另一个5mL离心管中，作为酶提取液备用。1.2.2酶活性的测定取洁净的试管18支，作标记，每一个样品设1个对照。总反应体积为0.5mL，测定管含0.2mL的酶提取液和0.3mL的1%淀粉溶液；对照管含0.2mL的酶提取液和0.3mL的0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH5.6,不含底物淀粉)将试管放入恒温40℃的水浴锅中，保温30min后取出，立即加入1.5mL的DNS试剂终止反应再将试管置于沸水浴中10min，取出后冰浴冷却。取反应液稀释10倍，测定波长520nm处的吸光值，同上做麦芽糖标准曲线，从标准曲线上查出麦芽

6、糖的含量，计算淀粉酶的总活性。周蓓云.α-和β-淀粉酶活性的测定.见：中国科学院上海植物生理研究所，上海市植物生理学会编.现代植物生理学实验指南.北京：科学出版社，1999.123~124酸性转化酶活性的测定1.酶的制备和活性测定酶的制备参照Miron&schaffer(199l)以及王永章等(2。02)的方法，稍做修改。提取缓冲液为:150mmol/lTris一Hcl(pH8.0)，10mmol/lMgC12，10mmol/l抗坏血酸，2mmol/LEDTA一Na，lmmol/LBenzadine(苯甲脒)，0.1mmol/LPMSF和0.2%(v/

7、v)ß一疏基乙醇，视发育阶段不同加入3%(w/，)PvPP。称取一定量的果肉，加入2-3倍体积冷的提取缓冲液，于高速匀浆器中快速破碎组织至匀浆，16000*g离心20min，上清液对稀释10倍的提取缓冲液(不含PvPP)透析20h，其间更换透析液3次。经透析的上清液用于可溶性酸性转化酶活性和数量的测定。离心得到的沉淀物用一定体积的提取缓冲液(不含PVPP)洗涤3遍，离心去上清液，沉淀用2~3倍体积的含0.5mol/LNaCI的提取缓冲液充分悬浮后，低温(4℃)下振荡浸提24h，16000*g离心20min，上清液透析后用于细胞壁酸性转化酶活性和数量的测

8、定。透析方法同上。可溶性酸性转化酶和细胞壁转化酶活性的测定参照Miron&Schaffer(1