大鼠热休克蛋白70(hsp-70)elisa试剂盒说明书

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1、大鼠热休克蛋白70(HSP-70)酶联免疫分析试剂盒使用说明书厦门慧嘉生物科技有限公司本试剂盒仅供体外研究使用!预期应用ELISA法定量测定大鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中热休克蛋白70(HSP-70)含量。实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗HSP-70抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗HSP-70抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的HSP-70呈

2、正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制1.酶联板：一块（96孔）2.标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为4,000pg/ml，做系列倍比稀释(注：不要直接在板中进行倍比稀释)后，分别稀释4,000pg/ml，2,000pg/ml，1,000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0pg/ml，临用前1

3、5分钟内配制。如配制2,000pg/ml标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）4,000pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。3.样品稀释液：1×20ml。4.检测稀释液A：1×10ml。5.检测稀释液B：1×10ml。6.检测溶液A：1×120μl（1:100）临用前以检测稀释液A1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100μl/孔），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl检测溶液A加990μl检测稀

4、释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。7.检测溶液B：1×120μl/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。8.底物溶液：1×10ml/瓶。9.浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。10.终止液：1×10ml/瓶（2NH2SO4）。11.覆膜：5张12.使用说明书：1份自备物品1.酶标仪（建议参考仪器使用说明提前预热）2.微量加液器及吸头，EP管3.蒸馏水或去离子水，全新滤纸标本的采集及保存1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后

5、于1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C1000xg离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。3.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。注：以上标本置4℃保存应小于1周，-20℃或-80℃均应密封保存，-20℃不应超过1个月，-80℃不应超过2个月；标本溶血会影响

6、最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。操作步骤实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分

7、钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干

8、）。6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。注：1.试剂准备：