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1、不同浓度葡萄糖对MG63细胞株TRAIL表达的影响来源：彩超探头http://www.51caichaoji.com【摘要】目的：观察不同浓度葡萄糖环境下人成骨肉瘤MG63细胞株肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及其护骨素（OPG）、护骨素配体（OPGL）的表达，探讨糖尿病骨质疏松症的发病机制.方法：用不同浓度葡萄糖(5.5,16.7,33.3mmol/L)分别刺激培养的MG63细胞24h，RTPCR法检测TRAIL，OPG，OPGLmRNA的表达，免疫组织化学法检测MG63细胞中TRAIL的表达及分布.结果：葡萄糖对MG63细胞中TR
2、AIL，OPGLmRNA的表达，均按照对照组、5.5mmol/L组、16.7mmol/L组、33.3mmol/L组顺序递增（P＜0.05），OPGmRNA的表达按照此顺序递减（P＜0.05）.33.3mmol/L组TRAILmRNA的水平明显高于对照组［(1.004±0.070)vs(0.740±0.023),P＜0.05］,TRAIL免疫反应阳性物质密度也明显高于对照组.结论：高糖环境可能导致成骨细胞中TRAIL和OPGL表达增多，OPG的表达减少，这可能是糖尿病骨质疏松症的重要发病机制之一. 【关键词】葡萄糖；MG63细胞；肿瘤坏死因子相
3、关凋亡诱导配体0引言糖尿病易并发骨质疏松症已被公认,糖尿病对骨代谢的影响主要表现为骨吸收增加,骨形成减少与缓慢,使骨矿物质含量减少和骨质疏松［1］.确切的细胞机制尚未阐明.肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand,TRAIL）是新发现的肿瘤坏死因子超家族的成员，可表达于人体的许多组织，对许多肿瘤来源的细胞具有很强的杀伤作用［2-3］，可介导病毒引起的凋亡［4-5］，并在一些自身免疫疾病中起作用［6］.但在糖尿病骨质疏松发病中是否起作用，目前少见报道.我们观察
4、不同浓度葡萄糖环境下具有人成骨细胞表型特征的MG63细胞株中TRAIL及其护骨素（osteoprotegerin,OPG）、护骨素配体（osteoprotegerinligand,OPGL）的表达情况,进一步探讨糖尿病骨质疏松症的发病机制.1材料和方法1.1材料第106代MG63细胞株由中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所惠赠；MEM培养液(Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)；牛血清白蛋白、Trizol试剂盒（Gibco公司）；逆转录反应试剂盒（Promega公司）；PCR扩增试剂盒和DNA梯度Marker（TaKaRa公
5、司）；引物由北京三博远志公司合成.鼠抗人TRAILmAb（本校免疫学教研室）；生物素标记的羊抗鼠IgG抗体（宝泰克公司）；ABC复合物（华美生物工程公司）；DAB（Sigma公司）. 1.2方法1.2.1细胞培养将第106代MG63细胞株以5×108/L密度接种于培养瓶或制成单细胞悬液接种于预先放置4张7mm×22mm盖玻片的培养皿中,用含100mL/L胎牛血清、50mg/L维生素C的无酚红MEM培养液,于37℃,50mL/LCO2条件下培养,2d换液1次. 1.2.2干预试验接种于50mL细胞培养瓶的MG63细胞达60%~70%汇片，行细
6、胞爬片的MG63细胞贴壁后即分别换含1g/L牛血清白蛋白的无血清MEM培养液培养3h,再分别用含不同浓度葡萄糖的MEM培养液干预,分为4组：培养基对照组；5.5mmol/L组；16.7mmol/L组；33.3mmol/L组.干预24h后,抽提细胞总RNA行RTPCR操作及免疫组化检测.以上各组实验均独立重复5次. 1.2.3RTPCRTrizol抽提MG63细胞总RNA.取2μg总RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA，再取1μLcDNA行PCR扩增OPG，OPGL，TRAIL基因，以βactin基因为内对照.OPG上游引物：5′AGTGGGAG
7、CAGAAGACATTG3′，下游引物：5′ATTGGACCTGGTTACCTATC3′，扩增长度为268bp；OPGL上游引物：5′GCGTCGCCCTGTTCTTCTAT3′，下游引物：5′TTGGTGCTTCCTCCTTTCAT3′，扩增长度为598bp；TRAIL上游引物：5′GGCATTCATTCCTGAGCAACTT3′，下游引物：5′GATCTCGTGATCTACCCACCTT3′，扩增长度为908bp.反应体系为25μL，双蒸水18μL，10×Buffer2.5μL,Taq酶0.5μL，上游引物各2μL，下游引物各2μL，模板1
8、μL.OPG反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s,55℃退火15s,72℃延伸30s，共30个循环，最后延伸10min.OPGL反应条件：
