基因工程技术制备的人源性抗mr 48×103 角蛋白抗体fab片段的纯化与活性鉴定论文

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1、基因工程技术制备的人源性抗Mr48×103角蛋白抗体Fab片段的纯化与活性鉴定论文.freelanantibody;Fab;preparation;i-dentificationAbstract:AIMToexpresshumanFabfragmentagainstMr48×103keratininE.coli，andidentifyitspurity，biningactivitiestheestablishedsemisyntheticphageantibodylibraryandtrans-formedintoE.colixL1-blue.ThespecificFabfragment

2、smobilizedmetalionaffinitychromatography（IMAC），theexpressedproductsentcouldbeefficientlypurifiedbyIMAC，andthepurifiedproductsanFabfrag-mentbyr48×103角蛋白的Fab阳性克隆RRKZ由海军总医院中心实验科王刚提供.该抗Mr48×103角蛋白的Fab阳性质粒含有抗角蛋白抗体的全部轻链基因（CL+JL+VL）及木瓜酶酶切位点以上部分的重链基因（CH1+JHD+VH），两部分基因克隆于可溶性Fab表达载体p3MH.该载体系在pB3H的基础上于基因Ⅲ3’

3、端加了6个组氨酸编码序列，以利于表达产物的纯化.表达产物为人源性抗角蛋白的Fab片段.诱导剂:异丙基-β-D半乳糖苷（IPTG）（Promega）.人表皮角蛋白抗原和IgG型AKautoAb由本室制备.HRP-羊抗人IgGFab抗体及镍离子螯合层析柱分别为Sigma公司和Pierce公司产品.1.2方法1.2.1人源性抗角蛋白Fab片段的原核表达将阳性克隆RRKZ的质粒转化大肠杆菌XL1-blue，挑取单集落在1.5mL2YT培养液中振荡培养至A600nm≈0.6，然后按1∶100扩大培养，3h后加IPTG至终浓度为1mmolL-1，37℃诱导过夜.次日收集菌液离心，上清中即含有可溶性F

4、ab抗体.1.2.2人源性抗角蛋白Fab片段的纯化人源性抗角蛋白Fab片段的纯化步骤基本按试剂盒说明进行.方法是:人源性抗角蛋白Fab片段原核表达上清先用50%饱和度硫酸铵盐析沉淀，pH6.8平衡缓冲液透析后上柱，分别用洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2洗脱非特异结合的蛋白，再用洗脱缓冲液解离特异的Fab片段，收集解离液，透析后经BCA蛋白检测试剂盒定量备用.1.2.3人源性抗角蛋白Fab片段的纯度与结合活性纯化产物经100gL-1SDS-PAGE鉴定纯度，并用纯化抗体与角蛋白以及无关抗原HBsAg、结蛋白、铁蛋白、胃蛋白酶等的ELISA反应判断其结合活性和特异性.各种抗原均以碳酸盐缓冲液（pH

5、9.6）稀释至1.25mgL-1包被酶联板4℃过夜，经10gL-1BSA封闭后滴加1∶10和1∶100稀释的纯化抗体洗脱液37℃孵育1h，PBS（T值.1.2.4蛋白印迹检测用于检测Fab的表达情况以及鉴定人源性抗角蛋白Fab结合角蛋白的组分.①将纯化样品在100gL-1胶浓度下进行SDS-PAGE电泳，并电转移至硝酸纤维素膜上，以50gL-1脱脂奶粉-PBS4℃封闭过夜，用辣根过氧化物酶标记的抗人IgGFab抗体结合，孵育、洗涤，DAB显色;②将角蛋白抗原在100gL-1胶浓度下进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后取下凝胶，转移至硝酸纤维素膜，以50gL-1脱脂奶粉-PBS4℃封闭过夜

6、，滴加纯化的人源性抗角蛋白Fab，室温摇床孵育2h，洗涤，加用辣根过氧化物酶标记的抗人IgGFab抗体再次孵育，洗涤，DAB显色.2结果2.1人源性抗角蛋白Fab表达与纯化用BCA蛋白定量检测试剂盒及ELISA定量估算，培养上清中可溶性Fab段表达的含量为120μgL-1.表达上清经50%饱和硫酸铵沉淀后，溶于PBS对平衡液充分透析后上柱，用50倍柱床体积的洗涤缓冲液充分洗涤后，用洗脱缓冲液解离，解离体积与蛋白浓度的相关曲线形成一锐利的单峰.收集解离液，经BCA蛋白检测试剂盒定量，计算回收率为47.2%.2.2可溶性抗角蛋白Fab纯度鉴定为鉴定经金属螯合层析所纯化的Fab段的纯度，将样品

7、浓缩后进行SDS-PAGE（Fig1）.可以看出，在还原条件下，可以看到Mr25×103的Fd段和Mr23×103的κ链.在非还原条件下进行SDS-PAGE，可见到Mr50×103的Fd与κ链的双聚体.进一步证实纯化组分中95.0%以上为Fab段蛋白.图1略2.3可溶性抗角蛋白Fab片段的抗原结合活性从用1∶100稀释的抗角蛋白Fab与各种抗原反应的测定结果（Fig2）中可以看出，抗角蛋白Fab片段与角蛋白具有良好的结合活性，而与H