hiv1 tat 蛋白结合tar的抗艾滋病药物筛选模型的建立研究

《hiv1 tat 蛋白结合tar的抗艾滋病药物筛选模型的建立研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、HIV1Tat蛋白结合Tar的抗艾滋病药物筛选模型的建立研究：李在留刘朝奇，邹坤，李凤兰，韩钰，杨凡，王磊黎【摘要】　　目的建立HIV-1Tat蛋白结合Tar的抗HIV-1药物筛选模型用于抗HIV药物筛选。方法构建表达HIV-1Tat蛋白的真核表达质粒（pCDNA3.1(+)-Tat）和HIV-1LTR-luc荧光素酶报告基因，采用脂质体转染法共转染HeLa细胞，荧光仪检测Tat蛋白促进荧光素酶在HeLa细胞内的表达情况，建立HIV-1Tat蛋白结合Tar的细胞模型，用于抗HIV-1的药物筛选。以DRB（5,6-二氯-1-β-呋核亚硝脲-苯并咪唑）为阳性对照，进行

2、模型的建立及条件的优化。结果通过反复试验表明，目的基因和报告基因的配比、转染时培养液中小牛血清的含量、细胞浓度、转染前细胞状态以及药物作用时间的长短等对模型的稳定性和敏感性有影响。结论应用优化的细胞模型对文冠果、紫苏等浸提物进行筛选及结果的分析。【关键词】HIV-1TatLTR-Luc荧光素酶基因艾滋药物筛选模型　　Abstract:ObjectiveToestablishHIV-1TalbindingtoTarmodel.MethodsHIV-1Tatproteineukaryoticexpressionplasmid（pCDNA3.1(+)-Tat）andluc

3、iferasereportgeneHIV-1LTR-luc(LTR-LUC)ine2000.TheexpressionofHIV-1TatproteininHeLacellsinometer.HIV-1TatproteinbindingtarmodelforscreeningHIV-1inhibitorsidazole)odelentsindicatethatthematchingofpurposegeneandreportgene,therateofneinmediumduringtransfection,densityofthetransfectedcells,

4、conditionoftheuntransfectedcellsandtheactiontimeofdrugsaffectthestabilityandsensitivityofthemodel.　　KeyRNA的翻译，导致病毒的复制增加［6］。本研究通过建立HIV-1Tat和LTR的结合，导致报告基因荧光素酶在细胞内的高表达，反映Tat和LTR序列的有效结合，建立Tat的反式激活效应调控病毒基因的复制与表达模型，从而用于天然药物有效成分的筛选，具有简单、快速、微量、费用低廉、安全、不受P3实验室限制，不用同位素等特点，可为实验室建立抗HIV-1药物筛选模型提供借鉴

5、与指导，具有较强的实践意义。　　1材料与方法　　1.1材料　　HIV-1Tat蛋白的真核表达质粒pCDNA3.1(+)-Tat及报告基因HIV-1LTR-luc(LTR-LUC)由三峡大学分子生物学研究所构建保存。HeLa细胞株由北京协和医科大学惠赠。Lipofectamine2000、Opti-MEM培养液均为Invitrogen公司试剂，新生牛血清（NCS）为GIBCO公司产品。DMEM培养基、胰蛋白酶、底物Luciferin、阳性对照DRB，细胞裂解液1,2-diaminocylclohexane-N,N,N,N-tetraaceticacid，考马斯亮兰等药

6、品均为Sigma公司产品。　　1.2方法　　构建表达HIV-1Tat蛋白的真核表达质粒（pCDNA3.1(+)-Tat）、HIV-1LTR-luc荧光素酶报告基因，采用脂质体转染法共转染HeLa细胞，荧光仪检测Tat蛋白在HeLa细胞内的表达情况，建立HIV-1Tat蛋白结合Tar的抗HIV-1的药物筛选模型。转染后的细胞加入对细胞毒性在20%以下的药物浓度，以DRB为阳性对照（Tat/Tar抑制剂，Manceboetal.,1997;Nekhaietal，1997），培养一定时间后收集细胞裂解液上清检测相对荧光值（RLU），考马斯亮兰（G-250）测定蛋白含量，在

7、蛋白含量统一的条件下，药物对Tat蛋白表达的抑制作用表现为药物组与空白对照组RLU的差值。　　1.2.1HeLa细胞脂质体转染实验按Lipofectamine2000的说明书进行操作：①转染前1天HeLa细胞以2×105cells/ml浓度接种到24孔板，0.5ml/孔，置37℃，5%CO2培养箱中培养过夜。②转染前1h对待转染细胞换等体积、新鲜、不含抗生素的DMEM培养液，置37℃，5%CO2培养箱中孵育1h。③DNA-Lipofectamine共沉淀物的制备：A：pCDNA3.1(+)-Tat与LTR-Luc的稀释与混合：pCDNA3.1(+)-Tat与LT