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1、常用得单克隆抗体检测方法通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成后，需要对抗体进行一个检测,本文介绍了几种常用得抗体检测得方法（1)免疫酶技术免疫酶技术就是将抗原抗体反应得特异性与酶对底物显色反应得高效催化作用有机结合而成得免疫学技术。由于它特异性强,灵敏度高,现已广泛用于筛选与鉴定单抗。①器材与试剂a、包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取0、2mol/LNａ2CO38mｌ，0、2mol/ＬNaHCO317ml混合,再加75ml蒸馏水,调ＰH至9、6。Trｉｓ—HＣl缓冲液(ＰＨ８、0，0、02mo
2、ｌ/L):取0、１mol/LＴｒiｓ1０0ml,0、1ｍol/ＬHＣl5８、4ml混合,加蒸馏水至1０00ml。ｂ、洗涤缓冲液(PH7、2得ＰBＳ):ＫH2ＰO４0、2g，KCl0、２ｇ，Na2HＰO4·１2H2O２、９g,NａCｌ8、０g,Ｔween—200、5ｍl，加蒸馏水至10０0ml。c、稀释液与封闭液：牛血清白蛋白(BSA)0、１ｇ,加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5—10%使用。d、酶反应终止液(2mol/ＬH2SO４):取蒸馏水1７8、3ml，滴加浓硫酸（98%）21、
3、7ml。e、底物缓冲液（PH5、0，磷酸盐－柠檬酸缓冲液）：取0、2mol/LNa２HPO４25、7ml,0、1ml/L柠檬酸２4、3mｌ，再加50ml蒸馏水．柠檬酸溶液及配成得底物缓冲液不稳定,易形成沉淀,因此一次不宜配制过多。f、底物使用液：OPD底物使用液(测49０nm得OD值）:ＯPD５ｍg,底物缓冲液10mｌ,3％Ｈ2O20、1５ml。ＴMBS或TMB底物使用液(测450nm得OＤ值)：TMBS或TＭＢ(1mg／ｍl）1、0ml,底物缓冲液１0ｍl,1%H2Ｏ225ｕl。ＡＢTＳ底物使用
4、液（测４1０nm得OＤ值）:ＡBTＳ0、5mg,底物缓冲液１ml，3%H2Ｏ22ul。g、抗体对照:以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照,以免疫鼠血清作为阳性血清.h、抗原:可溶性抗原:尽量纯化,以获得高特异性。病毒感染得传代细胞或全菌抗原。淋巴细胞等悬液。ｉ、酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其她类似试剂。j、细胞固定液:-2０℃丙酮;或丙酮—甲醛固定液：Nａ２ＨPO410０mg,KH2PＯ4500mg,蒸馏水15０mｌ，丙酮225ｍl，甲醛125ml；或丙酮—甲醛溶液(1；1)；或-20℃甲醇。k、聚苯乙
5、烯微孔板：４0孔、96孔、或条孔；硬板或软板均可使用．ｌ、酶联免疫阅读仪;或光镜.m、吸管、加样器及水浴箱、离心机等。②可溶性抗原得酶联免疫吸附试验(ELIＳＡ）ａ、纯化抗原用包被液稀释至1-２0ug/ml。ｂ、以50-100ul/孔量加入酶标板孔中，置４℃过夜或3７℃吸附2小时。c、弃去孔内得液体，同时用洗涤液洗3次,每次３-５分钟,拍干。d、每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭２小时；该步骤对于一些抗原,可省略。e、洗涤液洗3次;此时包被板可-2０℃或4℃保存备用。f、每孔加５0-100
6、ul待检杂交瘤细胞培养上清,同时设立阳性、阴性对照与空白对照;3７℃孵育1—2小时;洗涤，拍干。g、加酶标第二抗体,每孔50-1０0ul,3７℃孵育１—2小时，洗涤,拍干。h、加底物液，每孔加新鲜配制得底物使用液50—10０uｌ，37℃10-３0分钟。ｉ、以2ｍol/LＨ2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OＤ值.ｊ、结果判定:以P/N2、1,或PN+３D为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色,阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。③全菌抗原得ELＩSＡＳa、新鲜培养得细菌用蒸馏水或PBＳ悬
7、浮,并调整细菌浓度至1×１08个/mｌ。必须指出，对于人畜共患病病原体需注意安全操作,最好就是灭活处理。b、每孔中加１00ｕl５%戊二醛溶液(０、1mol/LNaHCO３９5mｌ＋25％戊二醛溶液5mｌ),３7℃作用2小时，蒸馏水洗涤3次;加上述细菌悬液５0ul／孔；37-5６℃烘干；每孔加2０0ul封闭液4℃过夜或3７℃２小时封闭.c、步骤b也可采用先每孔加5０uｌ细菌悬液，37℃—５6℃烘干，然后用—2０℃预冷得无水甲醇室温作用15分钟,蒸馏水洗涤３次;每孔加20０uｌ封闭液4℃过夜或3７℃２
8、小时封闭。ｄ、洗涤液洗３次;此时包被板可在—２0℃或4℃保存备用.e、以下步骤同上法。④用全细胞抗原得ELISＡa、按常规方法培养细胞,接种病毒，收获感染细胞与未感染细胞,进行细胞计数，用PＢS制成适当浓度悬液。ｂ、淋巴细胞悬液得制备采用新鲜外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴细胞分离液之上，1５00rpm离心3０分钟,吸取界面细胞洗涤二次，即为新鲜淋巴细胞悬液.该细胞悬液中若仍混有红细胞，离心后加0、８3%得氯化铵溶液，室温1０分钟,洗涤一次即可。将该细胞悬液稀释至适当浓度。c、每孔加
