第6章沉淀反应陈兆云ppt课件.ppt

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1、第六章沉淀反应重点与难点重点：免疫电泳技术的基本原理难点：免疫电泳中免疫固定电泳的原理及临床应用第六章沉淀反应第一节沉淀反应的特点第二节　液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验二、免疫浊度测定思考题小结第三节　凝胶内沉淀试验一、单向扩散试验二、双向扩散试验第四节免疫电泳技术一、对流免疫电泳二、火箭免疫电泳三、免疫电泳四、免疫固定电泳第一节沉淀反应原理及特点沉淀反应（precipitation）是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现的沉淀现象,其特性与经典的抗原抗体反应相同。第一阶段沉淀反应分两个阶段抗原抗体特异性结合，快速但不可

2、见。免疫比浊法中的速率法就是利用此阶段测定免疫复合物形成的速率。形成肉眼可见的大的免疫复合物。沉淀线或沉淀环的观察以及免疫比浊法中的终点法就是测定此阶段形成的复合物第二阶段免疫浊度测定絮状沉淀试验单向扩散试验双向扩散试验对流免疫电泳火箭免疫电泳免疫电泳免疫固定电泳液体内沉淀试验凝胶内沉淀试验凝胶免疫电泳技术沉淀反应可分三类第二节　液体内沉淀试验絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀物。方法受抗原抗体比例的影响非常明显应用于测定抗原抗体反应的最适比例(三种类型)一、絮状沉淀试验抗原稀释法

3、：抗原最适比例抗体稀释法：抗体最适比例方阵滴定法：抗原抗体最适比例絮状沉淀试验表6-1最适比方阵测定法抗体稀释度抗原稀释度1/101/201/401/801/1601/3201/640对照1/5++++++++++++±—1/10+++++++++++++—1/20+++++++++++++—1/40—±+++++++++—1/80————+++—当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量。原理二、免疫浊度测定

4、1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量2.抗体的质量：特异性强，效价高，亲和力　　　　　　　强并使用R型抗体3.抗原抗体反应液的最适PH为6.5～8.54.使用增浊剂影响因素免疫浊度测定1.透射免疫比浊法2.散射免疫比浊法3.免疫胶乳比浊法分类免疫浊度测定第三节　凝胶内沉淀试验可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。原　　理原理：抗体与待测的抗原,在两者比例合适的部位结合形成沉淀环。环的大小与抗原的浓度成正相关。

5、技术要点：将抗体混入0.9%琼脂糖内（50℃），未凝固前倾注成平板，凝固后打孔（直径3～5mm），孔中加入抗原溶液和不同浓度的标准品，置湿盒内37℃,24～48h观察孔周围是否出现沉淀环。定量试验一、单向扩散试验（平板法）抗体+琼脂沉淀环抗原倾注平板　打孔　加样　放置37℃　24～48h观察沉淀环单向扩散试验（平板法）沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法Mancini曲线：大分子抗原（IgM）时间扩散＞48h，常数K＝C∕d2普通坐标纸曲线Fahey曲线：小分子抗原（IgG,IgA）扩散时间24h常数K＝logC∕d半对数坐标纸曲线C为

6、抗原浓度，d为沉淀环直径单向扩散试验（平板法）T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线t1为16～24h；t2为24～48h；t3为48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线Mancini曲线Fahey曲线影响因素：抗体质量标准曲线，质控血清结果与真实含量不符单克隆抗体；多克隆抗体；可出现假性降低与增高双环现象不同扩散率抗原性相同的两个组分单向扩散试验上排为5个不同浓度的参考品；下排为患者血清，下排右2为异常病理血清单向扩散试验（平板法）原理：将抗原抗体分别加在琼脂糖不同的对应孔中，两者在凝

7、胶中自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径为3mm，孔间距在3～5mm之间，在相对的孔中加入抗原或抗体，放置湿盒37℃18～24h后，观察孔周围是否出现沉淀环。鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一二、双向扩散试验（平板法）应用1.抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计2.抗原或抗体相对分子量的估计双向扩散试验（平板法）应用3.抗原性质的分析双向扩散试验（平板法）应用4.抗体效价的滴定5.抗原或抗体纯度的鉴定双向扩散试验（平板法）第四节　免疫电泳技术优点：1.加快反应的速度。2

8、.提高了灵敏度。3.增加了分辨率。电泳分析＋沉淀反应抗原抗体反应的高度特异性电泳技术的高分辨率、快速、微量免疫电泳技术原理：双向扩散+电泳比双向扩散试验灵敏度提高8∼16倍技术要点：制备1.2