分子论文 利用ITS序列鉴定真菌.doc

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1、利用ITS序列鉴定真菌许文迎李彦龙(北方民族大学，银川，750021)摘要：【研究目的】了解利用ITS序列鉴定真菌的原理并掌握用ITS序列鉴定真菌的方法步骤；【方法】提取平菇基因组DNA后，对ITS基因组片段进行PCR扩增，并对ITS片段DNA的PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，再对ITS片段进行测序，最后对产物进行BLAST比对，鉴定属、种。【结果】运用ITS序列，可以鉴定出平菇属于pleurotus.，并对其作出评价【结论】平菇为真菌植物门真菌侧耳Pleurotusostreatus关键词：平菇，ITS基因组，PCR扩增，BLAST比对Identifymushroombyu

2、singITSsequenceXUwen-yingLIyan-long（BeifangUniversityofNationality,yinchuan750021)Abstract：【OBJECTIVE】TounderstandITSsequenceidentificationusingtheprincipleoffungiandmasterITSsequenceidentificationwiththemethodoffungisteps;【METHOD】OysterextractgenomicDNAtoITSgenomefragmentsPCRamplification,

3、andITSfragmentsofDNAamplifiedPCRproductforgelelectrophoresis,againtoITSfragmentssequencing,finally,theproductswerethanBLAST,appraisalgeneraandkind.【RESULTS】UseITSsequence,canidentifymushroombelongstopleurotus.,andITSmakeevaluation【CONCLUSION】Basedonthesystemtree,butalsocanjudgeitandtheresto

4、fthegeneticrelationshipbetweenbacteria.Keywords:Oystermushroom,ITSgenome,PCRamplification,BLASTcomparison1.引言菌物是真核生物的重要类别，传统的菌物分类以子实体形态特征和生理生化指标为分类基础，由于部分菌物的子实体不易获得，形态特征不易掌握，少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，使传统的菌物鉴定工作困难或分类系统意见分歧。内转录间隔区ITS（internaltranscribedspace），位于18S和5.8SrDNA（ITS1）之间以及5．8S和28SrD

5、NA之间（ITS2），ITS1和ITS2常被合称为ITS，并且5.8SRNA基因也被包括在ITS之内。近年来，利用真核生物在rDNA的ITS区段既具保守性又在科、属、种水平上均有特异性序列的特性，对ITS区进行PCR扩增、测序。随着核糖体rDNAITS序列分析技术在菌物研究中的应用，一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术得到了解决，一些重要的菌物遗传信息得到阐明。2、材料与方法2.1、试验时间、地点室内试验在2012年9月16日于北方民族大学分子实验室进行。2.2、试验材料2.2.1、1.仪器、用具：恒温水浴锅，移液器，离心机，核酸蛋白分析仪，琼脂糖凝胶电泳系统，

6、凝胶成像系统，PCR仪，离心管，微量移液器，枪头，一次性手套，PCR管(0.2ml)；2.材料：真菌组织、菌丝体或孢子；3.试剂：基因组DNA提取，特异性片段的PCR扩增，ITS引物（F：CCGTAGGTGAACCTGCGG，R:TCCTCCGCTTATTGATATGC）。2.2.2、平菇样本本研究使用的平菇样本为在超市购买的普通食用平菇2.2.3、所用测序仪器为ABI-PRISM3730，测序试剂为BigDyeterminator v3.1。2.3、试验方法2.3.1、基因组DNA提取1.CTAB溶液在65℃水浴中预热（使用前加入1%巯基乙醇）。2.取适量植物叶片置于研钵中

7、，加入液氮，用小杵磨至粉状，研磨期间及时添加液氮防止高温氧化。3.液氮中预冷小勺和离心管，取0.1-0.2g的研磨样品放入1.5ml离心管中，加入700μL的CTAB溶液，轻轻搅动摇匀，置于65℃的水浴槽中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出。4.室温冷却2min后，加入等体积Tris酚/氯仿/异戊醇溶液，颠倒混匀抽提15-20分钟。5.小心吸取上清液约600μL，加入等体积氯仿抽提10分钟，室温放置2分钟，10000r/min，离心10min。5.小心吸取上清液约500μL,加入等体积异丙醇或者