恒河猴粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基因合成、原核表达及纯化.pdf

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1、中国生物制品学杂志2012年3月第25卷第3期ChinJBiologicalsMarch2012，Vo1．25No．3·309··基础研究·恒河猴粒细胞．巨噬细胞集落刺激因子的基因合成、原核表达及纯化刘娟，陈丹，李璐，刘新颖，王冉，史洪娜，王维龙，沈林，刘勇，李鼎锋【摘要】目的人工合成恒河猴粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(Macacamulattagranulocyte—macrophagecolonystimulatingfactor，mGM．CSF)基因，在大肠杆菌中高效表达并纯化。方法根据大肠杆菌遗传密码

2、子偏爱性优化设计并合成mGM．CSF基因，克隆至原核表达载体pET．43．1a(+)中，构建重组表达质粒pET一43．1a—mGM．CSF，转化大肠杆菌BL21．CodonPlus(DE3)．RIPL，IPTG诱导表达。表达的重组mGM．CSF蛋白经SephacrylS-200分子筛层析纯化，复性后，Westernblot检测其反应原性，MTr法检测其生物学活性。结果重组表达质粒pET．43．1a．mGM．CSF经双酶切及测序证实构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为15000，表达量约占菌体总蛋白的30％

3、，主要以包涵体形式存在；纯化复性后的重组蛋白纯度可达95％以上，并可与大鼠抗人GM—CSF单克隆抗体特异性结合，比活性为l_2×10IU／mg。结论在大肠杆菌中高效表达了重组mGM．CSF蛋白，纯化复性后的蛋白具有良好的生物学活性。【关键词】恒河猴；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，重组；原核细胞；基因表达；纯化；生物学活性【中国图书分类号】Q78【文献标识码】A【文章编号】1004．5503(2012)03．0309．05Genesynthesis，prokaryoticexpressionandpurifica

4、tionofMacacamulattagranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactorLIUJuan，CHENDan，LILu，UUXin-ying，WANGRan，SHIHong-na，WANGWei—long，SHENLin，LIUYong，LIDing-feng(BeijingAbzymoBiosciencesCo．，Ltd，Beijing100176，China)【Abstract】objectiveTosynthesizeMacacamulattagranu

5、locyte—macrophagecolonystimulatingfactor(mGM-CSF)gene，highlyexpressinE．coliandpurifytheexpressedproduct．MethodsAccordingtotheE．coli—preferredcodon，mGM-CSFgenewasdesignedandsynthesized，andclonedintoprokaryoticexpressionvectorpET一43．1a(+)．r}leconstructedrecom

6、binantplasmidpET-43．1a．mGM．CSFwastransformedtoE．coliBL21．CodonPlus(DE3)一RIPLandinducedwithIPTG．TheexpressedrecombinantmGM—CSFwaspurifiedbySephaerylS-200molecularsievechromatography，re—naturalized，thendeterminedforreactogenicitybyWesternblot．andforbiological

7、activflybyMTrmethod．ResultsBothrestrictionanalysisandsequencingprovedthatrecombinantplasmidpET-43．1a—mGM—CSFwasconstructedcorrectly．Theexpressedrecombinantprotein．witharelativemolecularmassofabout15000．containedabout30％oftotalsomaticproteinandmainlyexistedi

8、naformofinclusionbody．Theproteinreachedapurityofmorethan95％afterpurificationandre—naturalization，andshowedspecificbindingtoratanti—humanGM—CSFmonoclonalantibody．Thespecificactivityoftherecombinantprote