用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法

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1、报告人：王浩丞2012年4月26日用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法主要内容DNA-DNA杂交16SrDNA在细菌分类鉴定的应用几种“看家基因”（Housekeepinggenes）在细菌分类鉴定的应用DNA-DNA杂交现代细菌分类学中，DNA-DNA分子杂交一直认为是作为细菌分类和鉴定的“黄金法则”。基本原理：使用DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的DNA在体外变性（高温或pH)，并在合适的条件下(盐类浓度和温度），使互补的碱基重新配对，测量杂交百分数(常以同源%表示；也有称碱基相似性%）百分数越高，杂交的两种DNA之间碱基线性

2、序列的相似性就越高，说明它们之间的亲缘关系也就越近。常见的几种方法：（1）标记法（2）吸光度法（3）荧光强度法等DNA-DNA杂交核酸杂交目前常采用固相杂交法，将待测菌株双链核酸解成单链固定在硝酸纤维素滤膜等固相支持物上，置入含有经标记的并解链的参照菌株的单链核酸(探针)液中复性，形成新的双链核酸，测定杂合双链的相对放射性强度来确定菌株问的同源性程度。计算公式：结果的判定：一般认为核酸杂交同源性小于20％为不同菌属，20％～60％为属内紧密相关的种，60％～70％为同种内不同亚种，大于70％为同一亚种。DNA-DNA杂交16SrDNA在细菌分类

3、鉴定的应用细菌核糖体的RNA含有3种类型，即23srRNA、16SrRNA和5SrRNA，它们含有的核苷酸分别约为2900个，1540个和120个。20世纪60年代末，Woese等学者开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类，他通过比较各类生物细胞的rRNA特征序列，认为16srRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。其主要依据为，它们为细胞所共有，其功能同源且最为古老，既含有保守序列又含可变序列，分子大小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应。16srRNA和16srDNA的区别：16S中的"S"是一个沉降系数，亦即反映生物

4、大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标，值越高，说明分子越大。rDNA和rRNA中的小写字母"r"是ribosome(核糖体)的缩写。rDNA指的是基因组中编码核糖体RNA（rRNA）分子的对应的DNA序列，也就是编码16SrRNA的基因。rRNA指的是rDNA的转录产物，它是构成核糖体的重要成分，核糖体由许多小的rRNA分子组装而成，其序列包含10个可变区（variableregion）和11个恒定区（constantregion），其中V1、V2、V3和V4共4个高变区，尤其是V2这一高变区，由于其进化速度相对较快，其中所包含的信息，足够用

5、于物种属及属以上分类单位的比较分析。因此，JohesSW和NellerHF等报道测定16SrDNA基因的部分序列即可达到鉴定的目的16SrRNA基因结构图第一，由于16SrDNA具有高度保守性，且分子小、包含的信息量较少，对于亲缘关系较近的细菌，其分辨率不高。第二，16SrDNA序列分析只能在属的水平上区分细菌，而在水平分类这个环节上仍然需要借助其他手段加以辅助分析。16srRNA序列和DNA-DNA同源性相关关系的研究表明:序列的相性不在99.8%以上就不能达到70%以上DNA-DNA的同源性。16srRNA总共约有1500bp,0.2%的不

6、同相当于3个碱基。由于数据库中的数据不一定完全而且个人读取数据也可能出现错读,因此由16srRNA序列鉴定种是很难的。16srRNA的同源性分析最适用于属及属以上的远缘关系。目前,已对2000种(约相当于50%)以上的真细菌的16srRNA进行了测序,不同菌属的16srRNA序列同源性为70%～95%,细菌核心基因（看家基因）虽然说细菌的基因组的大小和基因段是千差万别，但是无论多么小，它们必须包含有所有的信息去允许细菌去执行多种必要的功能，给予细胞维持内部的代谢平衡的能力，复制和进化，这三种主要的活细胞的功能。细胞经常能够吸收代谢物但其不是功能

7、蛋白，因此，它们必须去依赖它们自有的基因产物去执行不要的功能。1.信息的存储和加工DNA的代谢：（1）基本的复制功能（2）DNA的修复、限制和修饰RNA的代谢：（1）基本的转运功能（2）翻译（3）RNA的降解2蛋白质的加工、折叠、分泌3细胞的结构和细胞壁的加工4活跃且处于中间的代谢gyrB基因gyrB基因是普遍存在于细菌内编码DNA促旋酶中B亚单位蛋白的基因，属于信息通路中与DNA复制、限制、修饰或修复有关的蛋白编码基因。在大多数细菌中，以单拷贝的形式存在细菌基因组的rnpA—rmpH—dnaA—dnaN—recF—gyrB—rnpA基因簇中。

8、编码的是唯一一种能诱导DNA负超螺旋的拓扑异构酶一DNA促旋酶的B亚单位蛋白GyrB。DNA促旋酶是一种细菌Ⅱ型拓扑异构酶，在DNA复制及DNA超螺旋