地衣芽孢杆菌jf—un122碱性蛋白酶的分离纯化与性质

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1、维普资讯http://www.cqvip.com第33卷第3期工业微生物V0】．33No．32003年9月IndustrialMicrobiologySept．2003地衣芽孢杆菌JF—UN122碱性蛋白酶的分离纯化与性质袁铸，王忠彦，胡承，胡永松(1．第-：gi~大学成都军医学院医学检验教研室，成都610083；2．四川大学生命科学学院，成都610064)摘要地衣芽孢杆茵JF—UN122的发酵液，以硫酸铵分段盐析得粗酶，再经DEAE—SephadexA-50吸附色素、CM．SephadexC-50离子交换及SephadexG一75柱层析等步

2、骤获得电泳纯的碱性蛋白酶。SDS-PAGE测得其分子量为31．6KDa。以酪蛋白为底物时，酶的Km为5．26／ag／mL，Vm为20．8／ag／min。酶的最适pH为9．0，最适温度为55℃，pH5～11，55℃以下酶较稳定，对lmol／LH2o2具有一定的耐氧化性。PMSF对酶抑制，二硫苏糖醇(丌)有保护作用，钙离子、EDTA、SDS、尿素等对酶无明显影响。关键词：地衣芽孢杆茵；碱性蛋白酶；纯化；性质碱性蛋白酶广泛应用于洗涤剂、制革、丝绸等行Na2HPO4，0．04；Na2CO3，0．08；pH8．5。业，尤其广泛用于加酶洗涤剂⋯。1954

3、年，1．1．3有关试剂Hagihara纯化了枯草芽孢杆菌蛋白酶(Subtilisin)，DEAE—SephadexA_50，CM—SephadexC-50及1970年Keay等研究了Bacilluspumilus，B．sub—SephadexG一75系Pharmacia产品，国内分装；其余tilis和B．1icheniformis碱性蛋白酶，通过离子交换试剂为国产分析纯或化学纯。层析等方法将它们分离纯化，并把这些酶命名为芽1．2方法孢杆菌肽酶(Bacillopeptidase)。在国内，1984年，邱1．2．1碱性蛋白酶分离纯化秀宝等¨研究了

4、短小芽孢杆菌209碱性蛋白酶。取48h发酵液以6000r]min冷冻离心10min，收1993年，林斌等纯化了地衣芽孢杆菌2709碱性集上清液并加入硫酸铵，取0．30～0．50饱和度盐析蛋白酶，并对其性质进行了鉴定。为了将地衣芽孢物溶于少量0．05mol／L，pH7．4磷酸缓冲液中，透析杆菌(Bacilluslicheniformis)JF—UN122的酶学性去盐。然后将其上DEAE—SephadexA-50阴离子交质与目前碱性蛋白酶生产菌所产酶的酶学性质进行换柱(1．6×20cm)，用0．05mol／L，pH7．4磷酸缓冲比较，我们从该菌株

5、的发酵液中提纯了碱性蛋白酶，液及含不同浓度氯化钠的磷酸缓冲液，进行梯度洗并对其酶学性质进行了研究，从而为该酶的基因工脱，合并酶活性峰；将合并的酶活性峰溶液上预先用程改性提供了基础。pH7．4的磷酸缓冲液平衡过的CM．SephadexC-50柱(1．6×20cm)。当样品吸附完毕，开始线性梯度1材料与方法洗脱，合并酶活性峰后冷冻干燥；将一定量冻干酶粉1．1材料溶解后，进行SephadexG．75柱层析(1．6×1．1．1茵种100cm)，洗脱后收集酶活性峰，冷冻干燥后备用。地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)JF．1．2．

6、2酶活力测定UN122，四JlI大学微生物工程实验室保藏菌株。酶活测定及单位规定参照文献[6】，即Folin显色法1．1．2产酶培养基(％)测o．跏值并计算酶活力。酶活定义为1H】L酶液在糊精，6．0；黄豆粉，3．0；KH2PO,，0．3；测定条件下每分钟产生lpg酪氨酸为一个活力单位。第一作者简介：袁铸(1976～)。男，硕士，讲师。一25—维普资讯http://www.cqvip.com第3期工业微生物第33卷1．2．3纯度鉴定及分子量测定的蛋白峰(酶活性峰)，结果(图1)发现，酶活主要集采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

7、’】中在穿透峰，而大峰则由lmo1]LNaCI强行洗脱。1．2．4米氏常数(Kin)和最大反应速度(Vm)测合并穿透峰溶液，透析并冷冻干燥，然后溶于定[8】50mmol／L，pH7．4的磷酸缓冲液中。以酪蛋白为底物，用0．05mo1]L，pH9．5的硼酸2．1．2CM．SephadexC-50柱层析缓冲液配成不同浓度，然后与酶液40℃反应lOmin，将经过DEAE．SephadexA．50柱层析所得的酶用F0lin法测活力。根据lineweaver—Burk法计算出样上CM．SephadexC-50柱，并用含NaCI的磷酸缓Km及Vm值。冲液

8、进行梯度洗脱，洗脱后收集酶活性峰，结果见图2。2实验结果2．1F-UN122碱性蛋白酶的分离纯化盆2．1．1DEAE—SephadexA-50柱层析001．00．8