大鼠骨髓基质细胞体外培养的生物学特性.doc

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omaiinsicbeenn1ngxDrawthegrowthcureofeach<2«Caluredintheconditionalmedium(adding10~mmol/Ldesamethasonet10nimol/L^ghceroIphosphateand50mg/LVitaminCinDMEM),9changedtheliquoronceevery3daysinthecontrolgroup・ndinthetestgroupspassagedonceevery4daysinthetest肖roup.ALP(Alkalinephodphata$e)wasmeasuredineachgrouponceevery4days*TheformationofcalciumnodwasobservedwithVonKossa'staininginthe20thday.Result:LThegrowthvelocity*ofthecellsculturedinthecommonmediumwasobviously testgroupislowerthcinnginthelestgroupwasnegativeinthConclusion：1・AdheringancethodisBMSCs.2.BMSCscanbeobtain(havecabeservedastheseedingnherei$depressivere1ationshelieenthehipthatinthecontrolgroetestgroupandpIscreeningmaeasyandparate?deasilyandastrongosBMSCscellsinthebonetissueengidifferentiationaKeywords：bonemarrowstromai fasterthanthatintheconditionalmedium.2/rherewasasignicicsintdifferenceoftheamountofALPbetweenthecontrolgroupandthetestgroup(P<0.05),theamountofthetestgroupislowerthanthatinthecontrolgroup.TheVonKossa*staininginthetestgroupwasnegativeinthetestgroupandpositive.Condusion:LAdhcringandscreeningmethodisaeasyandreliablemethodtoseparateBMSC«.2>BMSCmcanbeobtainedeasilyandhaveastrongosteogeniccapacity;soBMSCjcanbeservedastheseedingcellsinthebonetissueenginetring3Keywords:bonemirrowstromalcell^esteogenetkpotential^cellculture■bioacthity .来川叭所星龙瞬侬紐奏銅稠錚近桂狄炀劇W师燧。凶骼柳|用他人的成社均已做出朝确标削询挪前顽•论文肉瘵釉榊轉克羁腸丙叙涵條何形超澜陳感艰.陇袖禽初3用拠鲫附囲船i跻感威烘/时嗣环脚同志财本删倆做的佣何漏嫌刃W轴铸％胭解泌溺聂葆丽谡馭本文如漩应H边&耐ujs除翔m顶责備利ft果，讥、童网学校授珈術证带'玄、WWO1关媒体上对作者本心命齣佈圏热扣杯斓灑辭测諭加，对JM济制媲烤购辅織翩船編繃鶯，輛细：MMt亀、本火血质购I渔文成果不实产生做轴郦,。诰鳩昨名日期$年5月，日本入完釦JWihffl®ttiteWf^affl、傲郦媲蹄的规定，H际铀保樹班愀瞬有关部门戒肌梅送觉伦垃ifim肿电用版"逾做碱砂I瞬軌郴廈奴曲幡料大学翊憐將体韵位M的定郁鮒分梅春編般撅爛轴H幽索・呼以猱紺t熾职捲御或翼他魏BW啊辭觸蚁廁昭侨他论文■本几海腰驗划ft威從】耐他血诚与该论S瀆損赧㈱网伦应感媚嫌汕承卷臟林学.（舷｛^&編密馳側峽定））課as搭 夫購骨爾秦廣细胸棒外境界的生密娜惟骨组須壬程執蕭藝三个塞東養熱L備無场威辭蛾郦圖臧劭。细腿砒城外源性细胞或局部组织细胸中诱辱分他而肠宓2・，潦删)flllifl出溯伽幽MlSl1i这修因子码映是局部或外源性经提纯的蛋白或植入细18的分淞产物・X,有脚删跚着、Wi和分化的基质支農°其全过程包站种子细銘她的嘶、、种子细胞和生删棵嫩命融合培养、复合体植入人体内三个步鼻“目前研宛较多的是科子细觑釣墙养剎，斷酬节働相藩性好的可降解材科的制造.典札种他116側妙痢M瞬訂抑«3淞融陲砒和遍釣壷婪的环节.脅巨大的再生能力罠示有购^自锻躍側曲諭翻&购的MHI&M在•亠碱认为.此类干细胞存在于骨.骨膜.骨■厦輿他曲啊K勘谕獅龍织枫怖岀曲同删有少量细胞继续存在”在机体撕侮昨翱脚的鮭讥多年来，国内外学者和紐正龄渚对备种纽织的细胞成骨能力进行了大It的研究S提出了定何性骨祖缁魁•锈暮桂删绷胞和基质IWBWI雜甲体绅翁海、培养.扩增出大量的有成辭&性幽啊《痕啊蠶触织的需要提供了羡师的藏民理1M爛繼如躍种脚#艷应側卜形砒点：仙)期躺斶S，对机体损伤小.(2卫在体待坍养连程戢貝稈牧強側传代林能能阳券曲诱镌爱臻僻定谢飭分化为康静细魁・(BP植汕机制8俯舷曉陵琢境兼保掬ft削阳《掛目飙前在研知牝使甩輪的作为种子细胞的成骨细離来源有一下宓:：«.««.骨外®U骨H和骨外细纵瞬珂.<究发现骨16来源的种子細寵具有来源广泛、瞰材简續、并有很强的分化潜能”liOLM<如傅Mitt选徂系统和基威系刼卿轴成.盼她括側f和關加类料,憎U基质是指能给造血系绒提鮒卿境晞般绷，典庇制伤酥源磁腸魏肿的働&細GeldsBMSCs).骨體基质细胞具有多向分化潜能⑷，可分化为成纤维细胞系、网状细胞系小k成耐鈿胞萦巴、懺翩例晰解舟融矽临的)他成传统认伽超线棗细魏翊初峻献细胞胞何和神经细胞，在一定的诱导下可定向分化为成骨细胞•本试验以大ftlBMSCs为富製对救驪建姆鬓•曲妙勢箱匏瞭'体外培弊咖附势泌栅療哺乳脚ft鹹b册卜嘲緇隧删待搶询郴场凝购紬執盘恤她盼幽軌SCS为试验对象，通过对JtBMSCs分离纯化、体外培养、扩增和诱导分化，观察哺乳动物BMSCs体外培养时生物学特性，以期为下一步构建组织工程人工骨提供优良的种子细胞。 血材锻a试謝m料体蓑加傀的①的倔ri尢鼬2aRn熾維枫•8時询也由觀我蹈耕凶需试瞼輔喙认验动物中提供•心探他2主要试剂2.IDMEM幽礪！JGIB1C0美国.胎串血満培养基G华美I牝鹹朋公司.務蛋曲隽公司。地赛脚检GIBIC0美国。S1GMA美国纟假仙（诫战钠SIGMA美国青阳索廿键蹲原钠存抗織性确酸轟弑劇盒貳尿博士徳生物工程有B!公司碱席僦喪蓝试剤血夙汉博士總MHE腥偷《K於词2.1.3签要雌设埶盒武汉博土徳生物工程有限公司2.ICQ鱒魏5试验设备SL-JC-2323美国超血歸台?SIr€J^IB—2323苏州倒襯显傲镜a^24OLWUS)F摄橡舷镜PJ^eBAD(OLYMRUS!US)13本低佩京辎HCBe^OftW(OLYMPUS)TH州砥册懊镒「燥希茶方•理型205W广州咆热鏈梃素燦箱丿硼恤濫水浴箱平io型2.1.4»tMBMfiGRANT美国2."D41辭梆略廠配制haCP—Hank's液配制&OgKC>ci(K4g)gNa出PO,•HQOg06g9MLROhpo.•h如g06gg90<35gc9 鹼红co：：0-.08g59酚红0.029 加双蒸水至1000ml,将定容的溶液抽滤(抽滤用双层孔径为0.22pm1滤膜)，所得的溶液置4°C冰箱备用。2)DMEM液配制DMEM干粉一包，加双蒸水至1000ml,使之完全溶解，0.22hm滤膜负压过滤后，分装，一2U°C保存备用。3)青霉索液配制青霉素针剂(80力U/只)，加双蒸水8ml,使之完全溶解，加双蒸水至80ml,0.22till滤膜负圧过滤后，分装，1—20°C保存备用。4)链爲索液配制链零素针剂(1.O吕/支)加双蒸水1Om1,使之完全溶解，加双蒸水至100M,0.22IIm滤膜负压过滤后，分装，一2012保存备用。5)DMEM培养基配制QTVTEK/T亍初&応T-r-i1-胎牛盘清15ml青霉素液(1000U/m1)1m1链霉素液(1000pg/ml)IM用lmol/LHCL及7.4%NaHCO.调整液体pH值至7.4。6)诱导培养基配制DM酬培养基中加入地赛米松在、13—甘油磷酸钠、维生索，使其浓度分别为地赛米松107哪o1/L、B-H'iWMlOmmo1/L、维生素C50ig/ml47)0.25%胰蛋自酶消化液的配制朕蛋口酶0.259,加D—Hank's液至1OOm1,磁力搅拌，使其完全溶解，0.221Im滤膜负压抽滤頂，分装，一2(JC保存备用。2.2试验方法2.2.1取材引颈法处死动物，75%酒巒浸泡1O分钟，无菌条件下切収双侧股骨、胫骨，剪断长骨干，显嘉骨惴腔，用含有肝素(100U/m1)的D-Hank，S液冲洗骨體腔，收集冲洗液，1000r/min 离心5min,弃上消，丿川入DMEM液,反复吹打均匀，接种到2个50mi培养瓶，每个培养瓶 屮加入含I5%胎牛血清(FBS)低糖DMEM培养基8ml,放入含5%C0：的37孵箱中培养。.2.2.2培养山氏氐畀*学位険直(1)原代培养訓嘛滴1他Me祿理訓帑灌糊4榊用艮皋糅飆城?嗖灌齡11题％后隔天的溶液黑41C冰箱备用.2)DMEM液配制DMEM-T粉一包，加双蒸水至lOOOnl,使之完全溶解，0・22»m滤膜负压过滤后，分装，・2(rc保存备用・3)青磁素液配制诗転素针剂(80万U/只人加双蒸水8ml,使之完全再解.加双蒸水至80mh0.22Pm滤浪负压过滤后，分装，■209保存备用・4)链馬素液配制链输素针剂(l・0g/支)加双蒸水10ml,使之完全溶解，加双蒸水至lOOml.0・22u血滤胆负压过滤J6.分装.-20X?保存备用.5)DMEM培养基配制DMEM液83nl・胎牛血清15ml青霉素液(1000U/ml)lai链？5靠液(1000ug/ml)lol用lmol/LHCL及7・4%NaHC0,调蔡液体pH值至7.4。6)诱导培养基配制DMEM培养基中加入地赛米松在、甘油磷酸钠、维生素.使其浓度分别为地赛米松10mnol/UB-甘油磽複钠lOmmol/L.维生索C50ug/iil・7)0.25%8SS白酶消化液的配制胰蛋白*0.25g,加D-Hank*s液至100ml,5g力搅样，使其完全溶解，0.22pm滤膜负压抽滤后.分装.・20匸保存备用.2.2试验方法22.1取材引颈法处死动物，75%酒精浸泡10分钟，无菌条件下切取双侧股骨.胫骨.剪晰长骨干，显露骨筋腔.用含有M^dOOU/nl)的"Hank's液冲洗件備腔，收集冲洗液rlOOOr/min离心5min,弃上淸，加入DMEM液，反复吹打均匀，接种到2个50«1培养瓶，每个培养瓶中加入含15%胎牛血淸(FBS)低ftDMEM培养基8tnl,放入含5%8」的37X?孵箱中培养.2.2.2培养(1)原代培养将培养瓶置于含5%Cft的37€卿箱中培养.24h全St换液，去除悬浮细胞，以后隔天典鬲黄至第築桶申耒站肇娴翹舫卅轍刪附耦y碼,無少妻離・（事2传傅前餡养 特到培养瓶中的细1!剌隆離偷励血帽哋緬削融Z3H2鱷机他的25%嘟潑触酚消化液适最（筋5»19谄统豁附歇W细脳究起風播剧够樹矚筱|!•时鉄魏雖啣HWfilll內Y化液并加血消中止消化，仔细出打后・1OOOr/nin离心5min,弃上淸.加入瞽通培养站・吸管吹打均佝牺取士#r燃液併繳卜根据计1数绷B）讶整砒浓鹿为、2冷1@九】瞬进翔传侦集养通删詡吸管吹打购嘩细胞接近融合时便用适量胰"消化液消化并传代.公j£取试验健级计数,根据计数结采调整细胞浓度为2x105/m1后进行传代培养。以后到贴甲BMSU扱捱梅高陵的畀伽腌询诡裁俐传媒似Q0代）培养会损坏细胞的功能，甚至岀现细胞關浓^另细，因此我们取生长良好的第3代细胞进行研究・（l）Bfflj；Cs具有高度的分化潜能，但过多的传代（A10代〉培养会摞坏细胞的功能，越至出现细«jrxlOVhil御趾接IW汨颂堆爺籤3橋谿燼皴狙棘ft加入200U1诱导堆养液，基础培养量基础培养液.放入含5%CQ的37V1B箱中培养，每3天换液•毎天各取11板.用MTT法测就毎孔吸光度值.共10天.以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生炊曲塚101/m1密度接种于96孔培养板，诱导培养组毎孔加入200IT1诱导培养（2）细0基础培羌JtlWM馴M酥#如乐50“储养粧C英30価3華础螂條組屮咖。加"删舔每天各眾;1跻增樽痔驚测渐W删值放具含8%82必时冏為鮒瞬养敗毎值天按液标绘制线3d,6d,9d,12d,15d时各别取3瓶.用超声细胞破碎仪破碎细胞，按碱性磷酸際蹄>酬明检测各孔的吸光度值，考马斯亮蓝试剂盒测样品蛋白量.根据公式算出碱性磷酸酹的含屣・105,（3）组说培养/m1密度接种于50ml培养瓶，共30瓶，基础培养组16瓶，加入基液;读訥錄祖11密丿峨称孑咖瞬谿放杨临比放管我瑚冷・7仝別加舛辭博养海3天换液，和诱牌培养液培养》每电，天换液，如天后分别取出各也细胞福片郦嘶细她脚染（叙碎细胞，按碱性磷酸袖編蜿斷检测各孔的吸光度值，考马斯亮蓝试剂盒测样品蛋口眾。根抓公式算出碱性磷酸酶的含量。（典瞥爭12・0统计软件・'计就跌料以均数土标准差表示。两组何计量贽料用t检验（Mest）.以P<0.05作为显著性闻验的谕I/171】密度接种于°孔培养板各I械’各孔放骨载玻片’分别加入垒础培养液和诱导培养液培养，每3夭换液，20天后分别取出各自细胞爬片行Yonkossa染色。2.3统计分析采用SPSS12.0统计软件。计量资料以均数士标准差表示。两组间计量资料用t检验（t-tcst）。以P枣殲絢母对彌&址驗交P<4）005o53.4Woo如ssr榮色i染色确定耆線桂干錮凰最可菲的方法悬检衲.胞分化耶囁矿他或匍粗嘶,«w脚1迪VdmKos珈如色识别粪蹄魁劇斷隔绷镜d!伽徐”染色结I柴显示剜瞬am创现的致密的•囲形的不透光团块呈现片状的棕染至.黑染•着色区域范国广.面枳大,腕现朋帥郦旳唳胭丿试衢卿迤?8烽4加就附筋染金黑染，若色区域范围广，而积大, 呈现明題的阳性反应。试验组染色阴性。（见图5） 444i、j経ill蜥编级壬程化骨用手疗的觀狮衣丿臥蔽韩獅滅嗣憾多敢材于人或动物的骨和骨膿组织.但冀来滋有1也制卿凰働劇輛齢蹶SM蜒细誓养成骨细胞具有取材方便.对机体視伤水的优层逐眦爪仙的熏禺爛竝纔细体外墙养技术的成熟是组织工程化脅应蜩的基冷前犍e菲炯Km谕«J删缠幽》鯉的生物学特性进行了观察和刪汇绷熬1＞散蝕翻和做他的翎痢u瓣、附谄《姗生物材料复合甘联合培养.复合体植入体内三个步IL其中，种予细胸的获取无疑般为奠娶的环节。种子细胞的获取和增养韭關细細濯翔斶删I艇提•删的钟伽机條繙如和針料⑴林料翻®I勸富U'融极鉤臧?附K2）易定向駅也咖档如胞甘绷鳳辭幽靱强的传代繁療能力；（B斶删徴強6用体內（砒6憑繇風糊砂福繭怖利细側的廉源撇契複何#＞骨熱骨H和骨外组织，综合比较以骨儘最优.其成骨潜能来噸于基處K肱撕删I度细胞冕未源于1HIM顾的一W碱舷側，圾侑钟»他踊蝕他FI的锈加#向^成骨细胞分化''巴八曉察制1基頰繼胸的蛋畅枕來養看其進逓盛能功刪殖能力强.拿.Wffl鹅宦，丄捋如绵猪嶼貓纽栗炭緻叩㈣劝啊《懈灌咖丫迅曲边《血Wi等的方法.第3備聊磁功的瞬溺删鲫胞,pm率咸”筍歸细纵卫稲学猶子絢地的Iw.钿.罰n豳湎細I&施饰痴阳核mcs细胞聽匱離牺际度匾髙，喲占祁核緞时血幽QQIW0.O呀3側财偏除檔和体外扩增就显得尤为重要.目前用于分蔑纯化®WS的那琳复删倂4桦金需喘妙册晤养糠渎尸、密度榔期讪法術jwm胞仪FCMCg））和删珠独（晌）幼"叫于冃敲爵苯发现囲sc$CS特异性御强的趣标潑纷托，酬lift熾翻釦HAGS脈MftCS,对黄进砸确的分淮确密麼搓：密度梯度喜右法避槪据骨U中各种细胞的比重不同而分离BM8（9C両貼删制趣》!堤喇曲稲昨bISCs有较軽的粘附贴璧能力对其分离包關ffB通过應谶脸删瀏用密彌翊絕滋扬做嘶琐，MJ»WT污染的机会.而分蔑細細噬沪»副你用斷慚加硏谿做，彳很难直接将它用于临曉冰另那删爾赦滋幽昨脣时腐的W环槻&，SL删劇胞的丿先长MW5?的表达都址不利的。本试验采用了全骨1K贴龜培养的方法，且早期保留了典他細1ft成分的存在"为BM8CS的牛股创塩创直好的娉耶境垛境”后期糊馳H8W矽的贴:蟹利刚換液J川换液可将不贴曜的造血細胞清除・我们培养的原代细胞貼壁生长，於7。天储磁雄腋京片形形态为细长梭形，在细胞传代时恤用篆般潮陶81胞由竣瑚昨側形、滩曙常匕hW层旅叠生长.而不出现接触抑«m».具有与處巒BlHBfim贩廡和生烯瘢」剧《1笨城出燄强:的甩出淆情舛,ALP足成熟戒蜩&胞的轴霸性毗性谓之目前渕为j乱內奋体外钙傩咻训化屮起着关懐恂制臥鮫爾阻W褪障締，幷砰械坏椰Mi抑！1琬，畑谪动钙化⑴》 OALErP钙他羅糜余躱先生。^<42.细殖册潇湘魁化蹴饥能甭捌miim命砌淹很木租度也依朗瀬辩耕条林养脇触讷解跖松、迫书•油晞8&幽』-抗坏刨碉翱瞬闻賊骨细9fe射fe的似俩鋼傀'於潮dpo呱停牒：¥oU1OS则伙为L-坏血酸能促进体外培养细胞合成胶原形成钙化，亦能调节ATP及ALP活性，且形响则侏成耐b刷榭缸披膺悯的殆谢诚躺紡細S息長嘛Ife成静细1&分曲程摩仪赫能rw响状态曲庖要指标炉制地塞米松蜒商無伺负涮物说删成的胞m细囲鞄報陵俊仙能欣签的嫌裁瞻休”这屜能采曲能毀細腮足糖皮质獵素徳锂祸地塞浙检報他程縫扈炉$毗体外碱堵描液扁城於地科I松溉以调帮瑚i»t细獅徹細m槪则侏横则帥幽质腕原的傷成液划wm超侏卷成时命肢胶療痢庖舫泌隊盼猱购爭娜胞外基质物I®卜鑒蹶》畑樹眷腐茄踩世強磷酸斯励趾为制她藏和堆聽撻删悯覘夕能蛾加喊啊酸債伍成骨Ilan细胞中的表达3妖面細瞪鬧性哽谢的涮戡卜硕曾咖她備等认伽堪删性歸嫌毂锻骨廟驰时的BUSES冰肪俛磁化鉛箭的抚®<沉凍试脸傩现噌通毎枫缈绷腦煥杏无朗显变化汕磷酸钠存接触抑制現象C无细胞缩的晡化編樹的出獨式姬的fe4M暗如細歸I赦販丿细敕见悔速屬期制94慢”鈿剜讎触语億缰逐沁期U钿砲细剜砂鯛渐伽麹禅緒拠的恶成咽耐燃妹节嚴妃凿剜i喋林央的编朧產卑圃艇旳;形感多阶散亦的細範緖犒SI能形成钙篦而矿閒勞化贼域制删區落血潮涮谕縫组细砌持埃儆鮎般而傩形咸棒形成蛮曲承为即细憾的碱删仙«麹遍騎相钿删的細0扌瑕爵橈鮭细胸分伽丿腐鹅的升裂則受剑抑制细'面勞裂低盛輪细胞抑制份枇a堀諦通時帥细他的欄佑［宙幽地他勺閃餾则腕的删也劃挪黜潮锻SMWI夥的战达孵!显輪翊照绷胞破林莽基魁缎胞连簇I删胞喲能砸film细轧世超S厲艘就附激制8!低（區-棚铀了，细滙喲旳啾养球能珮成成荐牺胞，也離殛繼常钱铐化結册囚为传代导致分裂叶:盛，抑制了细胞的分化，未能形成成骨细胞，也就不能形成钙化结节。5结论5结论1・木试验采用貼壁筛选法分离BMSCs,获得均一性较好的BMSCs.因此我们认为木试验1釆用的庖瀚疲俞覇删丛W$㈱曲疾用3便捷的踽想沏溉EMSCso冈此我们认为木试验2.砂林9K帧卿胞影体艸可踽分化为湖滑细，籾捷p»为咖R工程中种子细胞的2.来緞骨攏基质细胞在体外可诱导分化为成骨细胞，可作为骨组织工程屮种子细胞的3.发砚在骨舫基质细胞体外培养过程中一个乘要的生物学待性・即其增殖和分化存在3相购抑制的朕原庚细胞体外培养过程屮一个朿要的生物学特性，即其增殖和分化存在相W抑制的关系。 6参考文献[l]ProckopDJ.arroswtromalce1stemstopocellsfornoncce199276：35[2]HaynesworthSE,Gosergdb^-elCharacenicpolefromhum992：81—88・[3JCap1anAMesenchybuiIdin[4]Pitocksforsenehyma1cKenziec,Fiack[J]・7(6)：AM・pot4：14AW,Humanmesenchystcm・Ce1a[6]FukudaK・MolecularharacterintionoCdiomyocytesdoWadu1tmesenehyma1StemcutAe11s・Cong[7]PittengerMFfMackaam,BeekSC.etyofadu1thumamesenchymals1emceiis.Scienfrea1・n1n(1.vckaM・Fischeet[8]GtObrorar02,42(1epottrodifferenhumanstroma*semcellsintoearconrace1Iu1arcAMP.[9]sDC・HILLD.CARROLLJE・eta1・DTnaowcellsgeneHeil[j1Archbone004,61(4)：483—485・naJ,Abess,Shirna 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