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1、《饲料工业》·2006年第27卷第20期生物技术产纤维素酶芽孢杆菌的分离鉴定吴敏峰耿秀蓉祝小潘康成摘要采集健康奶牛的新鲜粪便,利用刚果红平板染色法分离筛选具有产纤维素酶活性的芽孢杆菌,并进行细菌菌落、形态和生化鉴定。结果从牛粪中分离出35株兼性厌氧的芽孢杆菌,利用刚果红鉴别培养基筛选出具有分解纤维素能力的菌株,并测定其水解圈大小,初步筛选出10株纤维素酶高产菌株,并对其进行了种属鉴定:一株为梭状芽孢杆菌,其余9株为芽孢杆菌属细菌。关键词纤维素酶;芽孢杆菌;分离;鉴定中图分类号Q814.1纤维素是植物体的主要成
2、分,是地球上数量最大0.3%、牛肉浸膏1%、葡萄糖0.5%、可溶性淀粉0.1%、的可再生性能源物质,利用微生物可将纤维材料转化L-半胱氨酸盐酸盐0.05%、NaCl0.5%、无水乙酸钠为饲料、化工等原料。随着能源紧张、环境污染和人口0.3%、CaCO30.1%、NaHCO30.1%、K2HPO40.4%、Mg-剧增等世界性问题的日趋严重,对绿色生态的呼声越SO4·7H2O0.05%、(NH4)2SO40.1%、MnSO4·H2O0.02%、来越高,因此,通过可再生纤维素资源的生物转化生琼脂粉1%、水1000m
3、l,pH值为7.0。[4,5]产葡萄糖和乙醇已成为一个十分重要的热门课题。而1.1.2.3CMC-Na培养基CMC-Na1%、蛋白胨这一应用的首要前提就是要分离到能够高产纤维素0.5%、酵母膏0.05%、KH2PO40.15%、MgSO40.02%、酶、有效分离纤维素的微生物菌种。目前研究较多的NaCl0.5%、琼脂粉0.8%,pH值为7.0。是霉菌,其中木霉、曲霉、根霉和青霉具有较强的酶活1.1.3试剂及溶液力,尤以绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉为典型,是目0.2%刚果红染液、5%醋酸、1mol/lNaCl。
4、[1]前公认的较好的纤维素酶生产菌。但霉菌为好气性1.2方法微生物,而饲料发酵、污物的纤维素类分解等都是在1.2.1细菌分离少氧或缺氧环境中进行的,故产纤维素酶活高的厌氧取新鲜粪便5g于95ml灭菌生理盐水中,振荡及兼性厌氧细菌更具有应用上的现实意义。出芽孢的摇匀,置于80℃水浴10min。按1%接种量接种于增细菌因芽孢的形成,在耐酸、耐碱、耐高温等方面有明菌肉汤中,37℃厌氧培养48h。取增菌培养后的菌液显的优势,更利于实际操作和工业生产,因此成为目于分离培养基上划线培养,置于厌氧缸中,37℃培养+前研究产
5、纤维素酶微生物的一个重要方向。48h后,挑取单个菌落染色镜检,取G芽孢杆菌继续1材料和方法纯化培养。1.1材料1.2.2纤维素分解菌的筛选及纤维素酶活力的初步[6-8]1.1.1样品采集测定从四川农大奶牛场采集健康奶牛新鲜粪便。将分离到的各纯化菌种活化,在CMC-Na平皿上[2,3]1.1.2培养基以3点种植,分别培养24、48h后,采用0.2%刚果红1.1.2.1液体增菌培养基胰蛋白胨1%、酵母粉染色30min,然后依次用蒸馏水和1mol/l的NaCl彻0.3%、牛肉浸膏1%、葡萄糖0.5%、可溶性淀粉0.
6、1%、底洗去染液,再用5%(m/v)的醋酸固定颜色。在菌落L-半胱氨酸盐酸盐0.05%、NaCl0.5%、无水乙酸钠周围形成染色圈的菌落证明芽孢杆菌产纤维素酶。用0.3%、水1000ml,pH值为7.0。游标卡尺分别测量透明圈直径(H)和菌落直径(C),选1.1.2.2菌种纯化培养基胰蛋白胨1%、酵母粉择两者比值(H/C)较大的10株菌株进行革兰氏染色,显微镜下观察及生理生化鉴定。1.2.3生理生化鉴定吴敏峰,四川农业大学动物科技学院,625014,四川雅安。耿秀蓉,四川省中医药研究院中医研究所。各种生长、生
7、理生化试验均以培养20~24h的斜祝小、潘康成(通讯作者),单位及通讯地址同第一作者。面为种子。收稿日期:2006-07-10除特别说明外,一般形态学观察和生理生化性状21生物技术吴敏峰等:产纤维素酶芽孢杆菌的分离鉴定[9]试验均参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第9版和《微生从牛粪便中筛选到的芽孢杆菌共35株,将纯化[10,11]物学实验》进行属和种的鉴别。的菌种点种于纤维素平板上,经刚果红染色,筛选出芽孢杆菌主要分5个属,用形态学观察、接触酶产纤维素酶的芽孢杆菌17株,经多次反复试验比较,试验、硫酸盐还原试验和需
8、氧性试验可以鉴定到属,得出其水解圈大小。各属依靠碳水化合物发酵和生化特性可以鉴定到种。根据刚果红染色结果,初步筛选出A1、B3、C、D2、2结果与分析D3、E1、E2、E3、F、M10株具有较高纤维素分解能力的芽2.1纤维素酶分解菌的筛选及测定结果(见表1)孢杆菌,对其进行生理生化鉴定。2.2形态学观察及生理生化鉴定结果表1纤维素酶分解菌刚果红染色结果2.2.1形态学观察菌种编号C(cm)H(cm)
