动物病毒学-实验四 病毒TCID50的测定.ppt

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1、实验四病毒TCID50的测定了解病毒感染力测定的几种方法掌握病毒接种方法及收毒方法掌握半数细胞培养物感染量(TCID50)的操作步骤、计算方法及含义一、实验目的二、材料吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、吸头PK-15细胞一瓶0.25%胰酶生长液（含10%血清）、维持液（含2%血清）伪狂犬病病毒液（PRV）三、病毒在细胞中的培养选长满单层的细胞，倒掉培养液。加入适量的病毒悬液置温箱中感作（吸附）45min-1h。取出瓶子，倒掉或不倒掉病毒液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至细胞病变。收毒：将病变的细胞置于-20℃冰箱中，冻结后

2、取出自然解冻，在解冻过程中要振摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落（尤其对于贴壁比较紧的细胞）。离心去除细胞碎片，然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器中。低温贮藏备用。分离野毒：如果怀疑病料中有可能有细菌污染，建议收毒过程中过滤除菌A正常IBRS-2BAB消化的IBRS-2AA正常PK-15B消化的PK-15C感染PRV的PK-15CB接种PRV后不同时间的PK-15BA首先是细胞的透明度降低，随后质内颗粒增加且收缩，由梭形细胞逐渐变为圆形，细胞与细胞之间仅由纤细的细胞间桥连接，细胞单层呈网状结构，进一步细胞间桥也随之消失，细胞脱落。正

3、常Marc-145细胞消化的Marc-145细胞BHK-21细胞A.正常HeLa细胞B.接种IBV后的HeLa细胞ABA.正常MDCK细胞B.接种AIV后的MDCK细胞A：正常的sf9细胞B：重组杆状病毒接种后2天的sf9细胞C：重组杆状病毒接种后3天的sf9细胞D：重组杆状病毒接种后4天的sf9细胞四、测定病毒感染力的方法半数致死量LD50(50%lethaldose)半数鸡胚感染量EID50(egg50%infectivedose)半数细胞培养物感染量TCID50（50%tissuecultureinfectivedose)蚀

4、斑形成单位（plaqueformingunit，PFU）稀释病毒：在离心管中将病毒作连续10倍的稀释，从10-1-10-8。（为避免混淆，可先将离心管进行相应标记。病毒混匀的方式？）接种病毒：将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100µl。滴加细胞悬液：在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2-3×105个/ml。五、TCID50的操作步骤对照：设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100µl生长液+100µl细胞悬液）结果观察：逐日观察并记录结果，一般需要观察4-6天。结果的计算：R

5、eed-Muench两氏法orKarber法123456789101112ABCDEFGH加100μL维持液2、加100μL稀释后的病毒液3、加100μL细胞悬液1、连续10倍的稀释实验结果观察：周五上午8:30-10:00六、TCID50的计算方法（CalculationofTCID50）10-110-210-310-410-510-610-710-8病毒液出现无CPE累计出现CPE孔稀释度CPE孔数孔数CPE孔数无CPE孔数所占的%10-180510100（51/51）10-280430100（43/43）10-3803501

6、00（35/35）10-480270100（27/27）10-580190100（19/19）10-67111191.7（11/12）10-7354640（4/10）10-8171137.1（1/14）1、Reed-Muench法CPE：Cytopathiceffect距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）＝（91.7-50）/（91.7-40）＝0.8lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数=0.8×(-1)+(-6)=-6.8

7、TCID50=10-6.8／0.1ml含义：将该病毒稀释106.8倍接种96孔细胞培养板，每孔100µl，可使50%接种孔的细胞发生病变。B和C点的距离=A和B点的距离×=10-1×0.8=10-0.8(B-C)(B-A)问题1：B和C点的距离？问题2：C点的位置？C点的位置=B点的位置+B和C点的距离=10（-6）+（-0.8）=10-6.82、Karber法病毒液稀释度出现CPE的孔数出现CPE孔的比率10-188/8=110-288/8=110-388/8=110-488/8=110-588/8=110-677/8=0.87

8、510-733/8=0.37510-811/8=0.125lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高浓度的稀释度的对数D：稀释度对数之间的差S：阳性孔比率总和lgTCID50=-1-1×(6.375-0.5)=-6.875TCID50=10-6