核酸抽提基础.doc

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1、1:核酸抽提原理简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。经典的裂解液几乎都含有去污剂（如SDS>TritonX-100>NP-40>Tween20等）和盐（如Tris、EDTA、NaCI等）。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境（如Tris）,还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏（如EDTA）、维持核酸结构的稳定（如NaCI）等。去污剂则是通过使蛋口质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋门质，从而实现核酸游离在

2、裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同吋，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂（如GIT、GuHCI等）裂解的,该方法已经成为了RNA抽提的主流，却不是基因组DNA抽提的主流。最常用的纯化方法，一是PC抽提+醇沉淀，二是介质纯化。第一种方法是利用PC对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醉将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。笫二种方法则是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与

3、蛋口质及盐的分离。高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了PC操作的麻烦。当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的PCR。其它杂质-如多糖、多酚等・的去除，基本上都是在这两种方法的基础上，通过增加一些特別的试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。2：了解你的实验样品如果你研究某个实验样品，并且要抽提它的核酸，以下的信息一定要先行收集：该样品的核酸含量、臨含量、特殊杂质含量。如果你对样品的特点一无所知，当样品稍微有一点复杂吋，抽提核酸的实验就会碰到许多问题。以血液为例，如果你不知道鸟的血液中冇核细胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血

4、一•样的起始量去捕提鸟血的基因组DNA,怎么可能成功？失败了又怎么知道原因所在？同时，只有对实验样品有所了解，才能正确选择裂解方法。绝大部分情况下，使用新鲜样品可以获得最好的结果。对一些杂质含量高的样品，如果使用新鲜样品抽提基因组DNA是碰到杂质残留过大的问题，可以试一卞-20C保存一天后再抽提的对策，可能会有意想不到的效果。样品如果因为某些原因必须先行保存，也要先简化一下样品：血液最好只保存有核细胞；将样品分割后保存，避免反复冻融。如果实验室不具备合适的保存条件，将样品先裂解后再保存，是一个不错的选择。3：裂解方法的评价含蛋白酶的裂解方法，可以认为

5、是抽提基因组DNA的肖选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组DNA相连接的蛋白质的游离。蛋白酚的作用是使蛋白质变小，故而对蛋白质的游离冇巨大的促进作用；同时，巨大的棊因组DNA是很容易“缠〃住大分子的东西的，蛋白质被蛋白解消化变小后，贝怀容易被基因组DNA“缠〃住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终获得的基因纽DNA的纯度更高。另外一个思路是，如果基因纽DNA与蛋口质“缠〃在一起，在纯化的过程中冇两种可能：如果基因组DNA的特性占优势，则纯化时以DNA的形式被保附下来，导致蛋白质的残附；如果蛋白质的特性占优势，则纯化时以蛋白质的形式被去除，导致DNA

6、的损失。有些样品，如肌肉，即使是RNA抽提，也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液（或者在操作中的某个时候使用蛋白酣消化蛋白质），原因在于这些样品中的蛋白质，是非常难以去除的。该方法是获得最人得率和最高纯度的基础。不使用蛋白酶的去污剂裂解方法，仍然在细胞革因组DNA抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时。控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用PC抽提的差一些。高浓度蛋白质变性剂（如GIT、GuHCI等）的裂解方法，是抽提RNA的首选。总RNA的抽

7、捉，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组DNA相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋口质“缠〃住的问题，因为都不会对以后的纯化产住大的影响，可以不考虑。高浓度蛋口质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的RNA酶，从而确保了RNA的完整性。除了极少量不适用该方法的样品-主要是植物，其它绝大部分样品的RNA的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。该方法也可用于基因组DNA抽提，非常快速简单，但纯度不是很高。含CTAB的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组DNA抽提的首选裂解方法。该方法成功与否与两个因索冇关：一是CTAB的质量

8、，二是洗涤的彻底程度。CTAB的质量对裂解效率有很大的影响，而且，似乎还说不清楚原因，因为即使是同一公司生产