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1、【实验九】DNA的粗提取与鉴定一教学目的1•初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法。2.观察提取出来的DNA物质。二教学建议在本实验的教学中，教师应注意以下几点。1.实验材料必须准备充足。本实验所用的实验材料是鸡血细胞液，由活鸡的鲜血经沉淀后获得。毎组（2个学生）需用5mL鸡血细胞液，则每班（50人）至少需要130mL,而鸡血细胞液与鸡血的体积比为1:3,这样每班至少需要390mL鸡血细胞液。宰杀1只中等大小的活鸡，-•般可得120mL左右的鲜血，因此,1个班实验需要买4只活鸡。如果不具备购买活鸡的条件，也可以到市场售活
2、鸡处去索取鸡血，但所带烧杯屮必须提前放入抗凝剂。2•盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本來就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此,实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管,这样可以减少提取过程屮DNA的损失。3•获取较纯净的DNA的关键步骤。（1）充分搅拌鸡血细胞液DNA存在于鸡血细胞的细胞核中。将鸡血细胞液与蒸僧水混合以后，必须用玻璃棒沿一个方向快速搅拌,使鸡血细胞加速破裂，并释放出DNAo⑵沉淀DNA时必须用冷酒精实
3、验前必须准备好人量的体积分数为95%的酒精，并在冰箱（至少5S以卜J中至少存放24ho（3）」1•:确搅拌含有悬浮物的溶液实验步骤3、5、7,都需要用玻璃棒搅拌。教师应提醒学生注意，在进行步骤3、5吋，玻璃棒不要直插烧杯底部，而且搅拌要轻缓，以便获得较完整的DNA分子。进行步骤7时，要将玻璃棒插入烧杯中溶液的中间，用手缓慢转动510mine三参考资料实验原理的补充介绍1.DNA的释放DNA位丁•鸡血细胞的细胞核屮,正常情况下不会释放出来。为了使DNA从细胞核中释放出来，实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸憾水并口搅拌的方
4、法。蒸谓水对于鸡血细胞来说，是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内,使血细胞破裂。同时，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），丁•是释放出DNA,当然也冇RNA。但是，释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋口质结合在一起。2•将DNA与蛋白质分离根据二者的特性,即在浓度较高的氯化钠溶液（物质的量浓度为2moL/L）中，核蛋口容易解聚,游离出DNAo而DNA在浓度较高的氯化钠溶液中的溶解度很高,Na+与带负电的DNA结合成DNA钠盐。这时DNA在溶液中呈溶解状态。2.DNA的析出与获取利用
5、DNA在浓度较低的氯化钠溶液中溶解度小的原理,向伤有DNA的浓度较高的氯化钠溶液中加入大量（300mL）蒸镉水，稀释氯化钠溶液，使DNA的溶解度下降，而蛋白质的溶解度增高（这就是蛋白质的盐溶现彖），从而使二者分离。这时，加上不停地搅拌,溶解度下降的DNA逐渐呈丝状物。再通过过滤，滤去蛋白质，就可以获取DNA的黏稠物了。如果采用离心法则更好，用4000r/min的旋转频率，离心15min,除去上清液（含冇蛋白质），留下的沉淀物中含DNA。3.DNA的再溶解再用较高浓度的氯化钠溶液去溶解DNA黏稠物。4.DNA的沉淀和浓
6、缩除去了蛋白质的核酸溶液,必须再进一步沉淀和浓缩。最常用的方法是酒精沉淀法。就是将含有Na+的DNA溶液,加入到相当于其两倍体积的体积分数为95%冷酒精溶液中，混匀以后可以使DNA沉淀、浓缩,形成含杂质较少的DNA丝状物，悬浮于溶液中。如果出现的丝状物较少，可以将此混合液再放入冰箱屮冷却几分。浓缩后的DNA丝状物，可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起（因为玻璃棒有吸附DNA的作用）。5.DNA的鉴定本实验屮鉴定DNA的方法为二苯胺法（配方见下述的“药品配制”）。二苯胺法的原理是:DNA中瞟吟核甘酸上的脱氧核糖遇酸生成3■疑
7、基・丫酮基戊醛，它再和二苯胺作用而显现蓝色（溶液呈浅蓝色）。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。二苯胺试剂的配制A液：15g二苯胺溶于100mL冰醋酸中，再加15mL浓硫酸，用棕色瓶保存。如冰醋酸呈结晶状态，则需加温后待其熔化，再使用。B液:乙醛的体积分数为0.2%的溶液。配制：将0.1mLB液加入到10mLA液中，现配现用。DNA粗捉取与鉴定的另一种方法1•材料用具新鲜菜花（或蒜黄、渡菜）。澈料烧杯，量筒，玻璃棒，尼龙纱布，陶瓷研钵，试管，试管架,试管夹，漏斗，酒精灯，石棉网,三角架，火柴，刀片，天
8、平。研磨液，体积分数为95%的酒精溶液，二苯胺试剂，蒸纟留水。2•方法步骤（1）DNA的粗提取%1准备材料将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室，至少24h。%1取材称取30g菜花，去梗取花,切碎。%1研磨将碎菜花放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨10min。%1过滤在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液滤入烧杯中（有条件的学校
