表达基因克隆技术与图谱构建策略研究

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1、第五章表达基因克隆技术与图谱构建策略研究人类基因组计划的主要任务之一就是要从人片段基因组区域或整条染色体DNA上鉴定出基因表达序列(geneexpressedsequences)或转录单位(transcriptionunits)□在人类基因组30亿个碱基对屮，发生转录的表达序列(即基因)仅占总序列的3〜5%。基因组屮绝大部分是基因间隔序列(intergenicseguences)或内含子(intron)和各种各样的巫复序列。测定基因表达序列可直接鉴别人类目而认定的6〜1()万(或仅3〜5万)个基因在染色体上的位置和排列顺序，这就是人类基因组计划所要构建的第四张图谱——基因

2、表达图谱，乂称基因转录图谱(geneexpressionmapsorgenetranscriptionmaps)。基因表达图谱是指细胞内所有染色体上表达基因的排列和分布，即指细胞中所^mRNAoH前，人们把很人精力投入到基因表达图谱的研究上，原因是表达基因序列是通过DNA序列的转录木一mRNA反转录成互补DNA(complementaryDNA,cDXA)获得的，即DNA外显子序列转录后形成RNA,经过剪切形成mRNAZ后，再将mRNA连接成模板，合成cDNA。因此，cDNA基因不包含非转录的内含子序列，这大大减少了测序的工作量，加快了测序进度，并可以有H的的直接针对某种

3、功能基因尤其是致病基因进行测序、克隆和鉴泄。I大I此,表达棊因图谱町作为致病基因诊断、克隆和基因治疗的工具，帮助科学家鉴定能指导蛋白质合成和引发疾病的DNA片段，在此基础上，针对疾病基因靶位进行药物设计。可见，表达基因图谱在医学和制菊上有重要的应用价值。构建表达基因图谱的前提条件是获得大量的基因转录本mRM序列(cDM),该部分序列经转录、翻译片可直接作为基因表达出來，所以，对cDNA的测序就是寻找基因的表达序列。在人类基因组测序工作中，“cDNA测序战略”是只测定转录的DNAJP列，而不是从“全基因组战略”的角度对所有碱基的排序进行测定。具有基因表达功能的cDNA乂称表

4、达序列标签(expressedsequencetag,EST),特定的EST序列冇时可代表特定的cDNA。实施此战略需从cDNA文库中获得一些长为300〜400个碱基序列的EST,英作用相当于全基因组测序时的序列标泄位点STS。1990年，人类基因组计划提出了人规模cDNA测序战略，并建立了表达序列标签EST测泄技术。KHS3U第一节表达基因的克隆策略80年代，科学家们曾试图通过分析基因产物一RNA或蛋白质获得各种组织尤其是疾病的表达基因，从而绕过连锁分析、图谱构建和DNA测序，直接找到表型与基因的相互关系。然而，事实证明,单纯依靠表型特征无法确定致病基因的具体位置和相关

5、功能，更难以确泄疾病与基因的巴接对应关系。随着疾病研究手段的不断发展和人类各种图谱的构建，以标记位点为基本研究工具的基因克隆使人类研究表型与基因的相互关系成为可能。基因克隆(genecloning)是指从基因组或DNA大片段屮分离并获得某一特定的基因或DNA序列，再通过DNA序列扩增形成由众多拷贝组成的一个DA片段群体的过程。目前，广泛应用于致病基因分离与克隆的策略可归纳为位置克隆(positionalcloning)>候选位置克隆(candidatepositionalcloning)>表型克隆(phenotypiccloning)等。一、定位克隆定位克隆的总体思路是

6、疾病——染色体定位——基因序列——mRNA/cDNA——蛋白质(致病基因产物)。定位克隆是通过分析患病家系的连锁关系确定致病基因的遗传方式，从染色体畸变引发的疾病入手，将染色体畸变的位置作为疾病基因克隆的一个位点进行分析的一种克隆策略，这种策略在基因组内尚无足够多态性位点提供某一疾病的连锁信息时，不失为一•种有效的致病基因克隆策略。因此，利用染色体畸变克隆致病基因是早期研究致病基因的一种重要手段Z-o随着人类基因纽遗传图谱和物理图谱的完成，人们可冇效地利用图谱标记确定与疾病性状的连锁关系，并获得这一区域的功能群，进行基因泄位克隆。所以，泄位主耍集屮在从重叠的克隆群屮筛选表

7、达序列，从定位的染色体区段内分离所要克隆的基因，经扩增后进一步研究其功能。二、定位候选克隆定位候选克隆是定位克隆的-种改进方法，是冃前被认为最有发展前途的基因定位策略。人类基因组草图问tttZ后，所有人类致病基因将很快被立位在染色体的某个区域，这样，可从某局部的序列片段中筛选出致病基因进行结构与功能分析，这就是定位候选克隆。此法是将图谱的一系列标记与连锁分析相结合，把与遗传病有关的基因定位到图谱的某一区域然后，利用己有数据查找到定位于此区域的所有己克隆的基因或cDNA,快速筛选染色体上与致病基因相关的可能位置，从中克隆出相关的