金线莲抗软腐病离体鉴定方法的研究

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1、金线莲抗软腐病离体鉴定方法的研究［摘要］以活体喷雾法作对照，研究不同离体接种方法、不同接种浓度以及不同叶龄对金线莲抗软腐病的影响。结果表明离体叶碟滴接法接种后金线兰和台湾金线莲Z间病情指数差异较大，能够比较明显区分其抗病性；当接种浓度为1.0X107cfu?mL-l时，病情指数差异较明显，能够较好地区分抗、感病品种；在4个月叶龄接种时，金线兰和台湾金线莲间病情指数冇一定的差异，能相对准确地反映品种间的抗性差异。采用离体叶碟滴接法，对4个月叶龄的金线兰与台湾金线莲接种浓度为1.0X107cfu?mL-l的细菌悬浮液，放入14h光照、28°C培养箱中培养5d后进行鉴定，其鉴定结果与活体喷雾法一

2、致，可用于金线莲抗软腐病离体鉴定，为金线莲抗软腐病的新品种选育及种质创新提供依据。［关键词］金线兰；台湾金线莲；软腐病；离体鉴定［收稿日期］2013-05-14［基金项目］国家自然科学基金项目(81303167)；浙江省自然科学基金项冃(LY13H280010)［通信作者］*胡润淮，Tel:(0571)63741273,E-mail:hurh57@163.com［作者简介］邵清松，博士，副教授，主要从事药用植物栽培与育种研究金线莲又名金线兰、金丝草，为兰科开唇兰属多年生名贵中药材，主产于福建、浙江、台湾、江西、贵州等地，具有清热凉血、除湿解毒等功效，用于治疗糖尿病、肾炎、急慢性肝炎等，在民

3、间享有“药王”的美称[1-3]o金线莲基原植物主要冇2种：金线兰Anoectochilusroxburghii和台湾金线莲A.formosanus。金线莲软腐病是金线莲主要病害z—,山软腐欧文氏菌黑茎病变种Eruiniacarotovoravar・atroseptica(IlellmersetDowson)Dye弓I起，属于细菌性病害，主要通过昆虫、雨水、农具等造成伤口和植株叶片的水孔和气孔侵染。金线莲软腐病一般可造成产量下降10%〜30%,严重时可达70%〜80%,病症初期表现为黑褐色斑点，犹如水渍状，继而扩人，危及整张叶片，使叶片迅速软腐，有明显汁液流，最后造成植株死亡[4-5]o国内

4、外曾报道一些抑制软腐欧文氏菌黑茎病变种生长的化学药剂，如链霉素、氧氯化铜、恶唾酸、30.3%四环霉素可溶粉剂和68.8%多保链素(甲基硫菌灵+链霉素)可湿性粉剂、代森猛、代森猛锌，但目前为止还没有防治软腐欧文氏菌黑茎病变种引起的植物软腐病的特效药剂[4,6]。日前抗病品种被认为是防治植物病害的有效手段，金线莲软腐病在抗性品种筛选方面国内外尚未有报道。本研究对金线莲软腐病苗期离休接种方法及发病条件进行研究，以期建立一套金线莲对软腐病抗性的苗期快速鉴定的方法，从而为金线莲抗软腐病的新品种选育及种质创新提供依据。1材料软腐欧文氏菌黑茎病变种，山浙江农林大学森林保护学科提供。供试材料为金线兰A.r

5、oxburghii和台湾金线莲A.formosanus,采自于浙江农林大学百草园金线莲种质资源圃，由浙江农林大学胡润雅教授鉴定。2方法2.1接种方法选取金线莲幼苗，参照蒲小明等［7］方法配置NA培养基，将软腐欧文氏菌黑茎病变种接种至NA培养液中，30-32°C,150r?min-l振荡培养24h时，菌液浓度稀释至1X107cfu?mL-lo接种方法为离体叶碟滴接法和离体叶碟针刺法，以常用活体喷雾法为对照。每个处理10株苗，3次重复。2.1.1离体叶碟滴接法参照黄德芬［8］采用的方法，稍作修改。具体步骤为：将剪下的叶片经流水冲洗后，95%乙醇处理30s,无菌水洗净，7%次氯酸钠溶液处理8mi

6、n,再用无菌水清洗干净，用直径为1.5cm的打孔器对叶片打孔，然后将处理好的叶片放入已灭菌带滤纸的培养皿内，加入无菌水保湿。将配好的菌液20uL滴于叶片中心，以滴无菌水作对照,放入14h光照、28°C培养箱屮培养。接种5d后调查病情指数，评价詁种抗病性。2.1.2离体叶碟针刺法叶片处理同离体叶碟滴接法，接种方法参照黄德芬［8］釆用的方法，稍作修改。具体方法步骤为：采用10支捆绑在一起的绢针蘸取菌液接种于处理后的叶片，以蘸取无菌水作対照，放入14h光照、28°C培养箱屮培养。接种5d后调查病情指数，评价甜种抗病性。2.1.3活体喷雾法参照李永镐等［9］采用的方法，稍作修改。具体方法步骤为：处

7、理前1d将金线莲幼苗进行保湿24h,笫2天用小型喷雾器将配好的菌液均匀的喷泗在植株叶片表面，以喷无菌水为对照，每1mL菌液喷接1株，接种后保湿24h,接种5d后统计病情指数，评价品种抗病性。2.2不同接种浓度的比较离体叶碟滴接法将配好的4个不同浓度梯度即1.0X106,1.0X107,1.0X108,1.0X109cfu?ml-l的菌悬液接种到叶龄为4个月的金线莲离体叶片上，放入14h光照、28°C培养箱中培养。接种5d