DB21∕T 2627-2016 鱼淋巴囊肿病毒实时定量PCR 检测方法

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1、ICS67.120.30B50DB21辽宁省地方标准DB21/T2627—2016鱼淋巴囊肿病毒实时定量PCR检测方法Thereal-timePCRdetectionmethodforLymphocystisdiseasevirusoffish2016-05-09发布2016-07-09实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2627—2016前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局；山东出入境检验检疫局；大连民族大学。本标准主要起草人：李

2、叶，岳志琴，杜雄伟，庞艳华，张雪，刘钊本标准系首次发布。IDB21/T2627—2016鱼淋巴囊肿病毒实时定量PCR检测方法1范围本标准规定了鱼类淋巴囊肿病毒荧光PCR检测的操作方法。本标准适用于鱼类淋巴囊肿病毒的检测、监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样SN/T2123出入境动物检疫实验室样品采集、运输、和

3、保存规范3缩略语下列缩略语适用于本标准：荧光PCR荧光聚合酶链反应。Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。DNA脱氧核糖核酸。Taq酶TaqDNA聚合酶。4仪器、耗材和试剂4.1仪器与耗材4.1.1荧光PCR检测仪4.1.2高速台式冷冻离心机4.1.3高压灭菌器4.1.4涡旋振荡器器4.1.5冰箱：4℃±1℃，-20℃±2℃4.1.6生物安全柜4.1.7微量可调移液器及配套带滤芯吸头4.1.81.5mL和50mL离心管4.1.9剪刀、镊子、研钵4.1.10石英砂4.2试剂4.2.1含50ug/mL链霉素的M

4、199细胞培养液。1DB21/T2627—20164.2.24%NaOH。4.2.30.9%灭菌生理盐水。4.2.420mg/mL蛋白酶K。4.2.510﹪SDS。4.2.6pH5.23M醋酸钠。4.2.7pH8.0TE缓冲液。4.2.8检测引物和探针，预计扩增产物82bp。正义引物P1：5’-CAAGCTATACAATCCAATTACACCAGTT-3’反义引物P2：5’-CAGCAGCAATACCCGGTAAATC-3’探针：5’FAM-TTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGCT-TAMRA-3’注：除特

5、别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验用水为GB/T6682规定的一级水。5操作步骤5.1样品采集采集患病鱼的皮肤、鳍、眼等囊肿、病变组织或采集无临床症状鱼的脑、脾、肾组织，4℃保存应不超过24h，若需长期保存应置-20℃以下，但应避免反复冻融，或放于加入冰块的保温箱中，密封后直接送实验室检测。按GB/T18088和SN/T2123执行。5.2样品处理将样品放于研钵中，加入1/10体积石英砂，研磨后，按1：10加入含抗生素50ug/mL的M199液后倒入50mL离心管中，4℃过夜或18℃2h，直接进行核酸抽提或4-20℃保存

6、备用。5.3提取DNA在处理完的样品中加入1.5mL4％的NaOH溶液，同时设立阴性对照和阳性对照，37℃恒温处理30min或常温下1h，使其充分液化；若液化不完全，可适当再加入少量4％的NaOH；将液化后的样本500μL分别加入1.5mL无菌离心管中，13000r/min离心10min；弃上清，用微量移液器尽量吸干液滴，沉淀中加入1mL灭菌生理盐水，振荡悬浮，13000r/min离心10min，弃上清，加入1mL灭菌生理盐水，13000r/min离心10min，弃上清，用0.5mL灭菌生理盐水重新悬浮沉淀，加12.5μL20m

7、g/mL的蛋白酶K和50μL的10﹪的SDS，55℃水浴作用30min；分别用Tris饱和酚、等体积酚：氯仿和氯仿各抽提一次；吸取上层水相，加1/10体积的pH5.23M醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀2h，4℃13000r/min离心10min；弃上清，加入75﹪的乙醇，4℃13000r/min离心10min；弃上清，晾干，加20μLTE缓冲液溶解，直接用于检测或-20℃保存备用。注：可以采用等效商品化DNA提取试剂盒进行操作。5.4样本的检测5.4.1扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出相应的荧光P

8、CR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2000r/min离心5sec。设被检样品总数为n，反应体系配制见表1。表1反应体系的配置（25μL）PCR反应体系中各成分每个样品反应组分用量（μL）总样品反应组分用量（μL）2DB21/T2627—20162+10×PC