遗传代谢性疾病的基因诊断

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1、第十九章遗传代谢性疾病的基因诊断第三军医大学府伟灵黄庆退出卫生部“十一五”规划教材全国高等医药教材建设研究会规划教材主要内容前　言一、基因诊断技术二、遗传代谢性疾病的基因诊断细胞、组织、器官和机体的生存与功能维持都必须依赖不断进行的物质代谢过程。物质代谢包括合成代谢及分解代谢两个过程。代谢性疾病是物质代谢过程的紊乱，多为酶或蛋白异常所致。根据代谢性疾病的病因，可将其分为原发性和继发性。前言返回章二、代谢性疾病的诊断手段一、代谢性疾病的分类一、代谢性疾病的分类原发性代谢性疾病：又叫先天性代谢性疾病。是指当编码物质代谢所需酶或蛋白的基因发生突变、不能合成或合成了无活性的产物时，就

2、会导致有关代谢途径不能正常运转，造成具有不同临床表型的各种代谢缺陷病。继发性代谢性疾病：继发性代谢性疾病是由其它原发性疾病导致的代谢性疾病，如糖尿病导致的继发性高脂血症。返回节二、代谢性疾病的诊断手段过去：主要依靠与物质代谢相关的各种酶的生物化学方面的诊断现在：生化诊断+基因诊断返回节基因诊断的概念基因诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法,直接检测基因结构及其表达水平是否正常,从而对疾病作出诊断的方法。返回节基因诊断的特点针对性强特异性高灵敏度高适用性强诊断范围广返回节第一节基因诊断技术二.聚合酶链反应技术三.毛细管电泳技术四.基因芯片技术一.DNA测序技术返回章一

3、、DNA测序技术所有生物基因组序列的数据均来自DNA测序特点:稳定简便自动化程度高数据准确可靠公认为国际金标准返回节双脱氧链终止法原理:测序基础是以ddNTP为测序反应的链终止剂掺入到延伸链中的ddNTP可阻止后续ddNTP或dNTP的掺入返回节返回节示例：BigDye™Terminators循环测序反应扩增到未端为BigDye™Terminators的一系列的核苷酸链。循环测序反应产物经沉淀、洗涤和纯化，从而去除多余的未反应的BigDye™Terminators。电泳与结果分析。返回节返回节焦磷酸测序技术原理:引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和

4、三磷酸腺苷双磷酸酶等4种酶的协同作用下，将每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，以荧光信号的形式实时记录模板DNA的核苷酸序列。返回节返回节ABDNAPolymeraseACCTTGAATTCGTCCTAGGA……GGATCTT……dNTPApyrase(d)NMPPPiATPATP-sulphurylaseLuciferaseLightCTGCTTAAAGTCAGTCAGTCAGTC基本流程：第1步一个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物(包括DNAPolymerase、ATPSulfurylase、Luciferase

5、和三磷酸腺苷双磷酸酶Apyrase)和底物混合物(包括腺苷酰硫酸APS和Luciferin)。返回节基本流程：第2步向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。返回节(DNA)n+dNTP(DNA)n+1+PPi聚合酶基本流程：第3步在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值高低则和相匹配的碱基数成正比。返回

6、节基本流程：第4步反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。返回节dNTPdNDP+dNMP+PiATPADP+AMP+PiATP双磷酸酶ATP双磷酸酶基本流程：第5步加入另一种dNTP，使第2－4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息返回节DNA序列GGCC-TAAGGGCCCTT核苷酸递增返回节焦磷酸盐测序法步骤二、聚合酶链反应技术PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法。四种主要成分：DNA模板、引物、DNA聚合酶和dNTP。三个反复步骤：高温变性、低温退火和适温延伸。返回节三、毛细管电泳技术毛细管电泳统指以高压电场

7、为驱动力，以毛细管为分离通道，依据试样中各组分间淌度和分配行为上的差异来实现分离的一类分离技术。基本原理是根据在电场作用下离子迁移的速度不同而对组分进行分离和分析。返回节返回节变性高效液相色谱(DHPLC)是一种新的高通量筛选DNA序列变异的技术，其原理是利用离子对反向高效液相色谱原理,通过一个DNA分离柱，进行核苷酸片段的分离和分析。四、基因芯片技术基因芯片技术就是指将大量特定的靶基因片段或寡核苷酸片段作为探针有序和高密度地排列固定于玻璃和硅等固相载体上，然后检测与待测的不同荧光标记样品基