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1、使用Oligo6和PrimerPremier5.0等软件设计PCR引物张新宇(中国医科院肿瘤研究所，北京100021)11_1了邮件:zhangxy@pubem.cicams.ac.cn在当今分了生物学研究中，PCR技术已成为使用授多，最广泛的技术Z-o而引物设计是PCR技术中至关重耍的一环。在PCR扩增以前，一般模板序列已被全部或部分确定。要想扩增出理想的目的片断，-•般都得通过正确设计PCR引物。也有的人不经过设计直接取模板序列的两个片段作为引物，这样很可能导致实验失败，如扩增出多条帶(引发错配所致)，不出目的带或出日的带很弱(引物引发效率低下)，引物二聚体带(引物与引物之
2、间形成稳定二聚体)等等。现在PCR引物设计都通过计算机软件进行。生物信息学发展至今日，具有引物设计功能的软件有很多，其中大部分是免费软件，可总接从网上下载，安装并运行。这类软件大都简单易用，但其引物设计功能一般不很强，通过它们设计的引物常常不尽如人意，而专门进行引物设计的商业版软件功能强大，但使用起來不太容易。本文就这一问题进行探讨。引物设计的原则引物设计有儿条基本原则：首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非冃的位点引起DNA聚合反应(即错配)。I韦I绕这几条基木原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度(primer
3、length),产物长度(productlength),序列Tm值(meltingtemperature),AG(S(internalstability),引物二聚体及发夹结构(duplexformationandhairpin),错误引发位点(falseprimingsite),引物及产物GC含量(composition),冇时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo软件分析设计引物为例，笔者总结岀以下的要点：1.引物的长度一般为15-30bp,常用的是18・27bp,但不能大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74°C,即Taq酶的最适温度。2.引
4、物3,端的序列要比5,端重要。引物丁端的碱基一•般不用A,因为A在错谋引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间丁端的互补、二聚体或发夹结构也口J能导致PCR反应失败。5,端序列对PCR影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。3.引物的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太人。4.引物所对应模板序列的Tm值最好在72°C左右。5.AG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的AG值授好呈正弦曲线形状,即亍端和中间AG值较高，而3,端AG值相对较低，且不要超过9(AG值为负值，这里取绝对值)，如此则有利于正确引发
5、反应而可防止错误引发。6.可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错谋引发的引发率一般不要高过100,如此可保证不出非目的产物的假带。1.引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5,否则容易产生引物二聚体带而H•会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱棊的分布,3,端的连续GGG或CCC会导致错谋引发。1.対引物的修饰一•般是增加陆切位点，应参考载体的限制酚识别序列确定，常常対上下游弓I物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件
6、较差，比如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；有吋PCR产物耍作为克降对彖插入到载体中表达，因此PCR引物设计的可选择度很低。遇到这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件，这时，使用自动搜索引物及正确地评价引物可使研究人员对实验心屮有数。引物的自动搜索和评价分析带冇引物设计功能的软件冇很多，大都是ForWindows版本的。在此特别推荐两个专门性的引物设计软件（商业版）：PrimerPremier5（以卜-简称Premier）和Oligo5.0/6.22软件的引物设计功能主要体现在两个方而，首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以Oli
7、go软件最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此口动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，口动搜索功能以Premier为最强且方便易用,Oligo软件其次,其他软件如VectorNTISuit,Dnasis,Omiga,Dnastar都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。当然要想保证得到效果理想的引物，在自动搜索的基础上，还要对引物辅以人工分析，以得到最佳设计的引物。因此,笔者认为引物设计软件的最佳搭配是Oligo和Premier软件一起，以Premier
