SOCS-1对TNF-α诱导人近端肾小管上此细胞凋亡的影响

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1、中文摘要SOCS．1对TNF．a诱导人近端肾小管上皮细胞凋亡的影响摘要目的：目前我国肾脏疾病，尤其是糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)的发病率不断上升。DN是糖尿病患者最严重的并发症之一，其发展至晚期往往会导致终末期肾功能衰竭，严重威胁人类的健康。DN的发病机制非常复杂，涉及到遗传、代谢、生长因子、细胞因子等多种因素。随着研究的不断深入，人们发现肿瘤坏死因子0【(tumornecrosisfactor-a．TNF．11)可能为参与糖尿病肾病发生、发展的一个不可忽视的关键性细胞因子。在DN动物模型和DN患者

2、中，TNF．仅的表达水平均有升高，提示n师．11参与了DN的发生与发展。TNF．0【由157个氨基酸构成，除造血细胞外，肾脏固有细胞(主要是系膜细胞、肾小球细胞和肾小管上皮细胞等)也可产生TNF．Q。TNF．仅具有广泛的生物学活性，与细胞的分化、增殖及凋亡有关。有实验表明，TNF．Q可以诱导负鼠肾脏近端肾小管上皮细胞发生凋亡。但有关TNF．a能否诱导人肾近端肾小管上皮细胞发生凋亡的研究却鲜见报道。Janus激酶／转录激活因子(ianuskinases／signaltransducersandactivatorsoftranscr

3、iption，JAK／STAT)信号途径是细胞因子信号转导的重要通路之一，在肾脏疾病的发生发展中起重要作用。STAT是JAK激酶的底物，与酪氨酸磷酸化信号通路耦联，从而发挥转录调控作用。细胞因子信号转导抑制蛋I兰t(suppressorsofcytokinesignaling，socs)家族是一类由细胞产生、可反馈性阻断细胞因子信号转导过程的负性调节因子，其对JAK／STAT信号通路起负调控作用。SOCS可能通过抑制J舢“S吖汀信号对DN发挥保护作用。现在尽管已经证实TNF．仅诱导的细胞凋亡与JNK及NF—r,B两条细胞信号转导

4、通路密切相关，但对于JAK／STAT信号通路是否也在其中发挥一定的作用以及SOCS．1干预后能否抑制TNF．0【诱导的细胞凋亡等问题却知之甚少。因此，本实验着重观察了TNF．仅对人肾近端肾小管上皮细胞(HKC)凋亡和JAK／STAT信号激活的影响以及JAK／STAT信号特异性阻断剂(AG490)和SOCS．1过表达对TNF．仅诱导细胞凋亡和JAK／STAT通路的影响。初步探讨TNF．Q诱导HKC凋亡及凋亡过程中JAK／Sn盯信号通路的激中文摘要活和SOCS．1基因的作用等问题，以期为DN的防治提供新的依据和策略。方法：l材料：人

5、肾近端肾小管上皮细胞株HKC；pCR3．1．SOCS．1稳定转染人肾近端’肾小管上皮细胞细胞系；pCR3．1．vector空质粒稳定转染人肾近端肾小管上皮细胞细胞系；TNF．仅；AG490。2方法：2．1用甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定HKC细胞株的增殖情况，以确定TNF．a的半数抑制浓度(IC50)：设立空白对照组(contr01)、溶剂对照组(solvent)、药物组；药物浓度为5ng．ml～，10ng．ml一，20ng．IIll～，40ng．rnl～，80ng．ml～，160ng．ml一。作用时间：24h，测定IOD值，计算

6、细胞生长抑制率，根据公式确定IC50，作为本实验中TNF．仅的刺激浓度。2．2实验分组：实验细胞分成5组，分别为：对照组(N)；TNF．仅组(T)；TNF．Q+AG490组(T+A)；TNF．Q+pCR3．1．SOCS．1转染组(T+SI)；TNF．Q+pCR3．1-vector空质粒转染组(n-V)；分别经细胞同步化、分组干预及刺激后收集细胞，进行观察检测。2．3检测指标：2．3．1流式细胞定量检测技术(flowcytometry,FCM)检测各组细胞凋亡率。2．3．2琼脂糖凝胶电泳(agarosegelelectrophor

7、esis，DNALadder)检测细胞凋亡。2．3．3末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸．生物素缺口末端标记法(terminaldeoxynucleotidetransferase-mediateddeoxyuridinetriphosphate．biotinnick-endlabeling，TUNEL)检测各组细胞凋亡率。2．3．4应用蛋白免疫印迹(WesternBlot)方法检测各组细胞P．STATl、P．JAK2蛋白的表达情况。结果：1TNF．Q对HKC细胞株增殖的影响MTT法测定显示：TNF-a作用于HKC细胞24h，

8、IC50为18．59ng．mLl。TNF．a对HKC细胞的增殖有抑制作用，并且随着药物浓度的升高，抑制作用逐渐增强。当药物浓度达到160ng．mL"1时，TNF．仅的抑制率接近80％。溶剂对细胞的生长未见明显影响。中文摘要2TNF．O【诱导HKC凋亡及其对P．S