GBT 17999.9-1999 SPF鸡间接免疫荧光试验

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1、GB/'r17999.9-1999前言鸡传染性贫血(CIA)，是近年来新发生的鸡病，国外均对其进行监测.CIA在我国鸡群中也有流行，因此，SPF鸡微生物学质量控制国家标准将其列入监测项目。目前国内已建立了SPF鸡监测CIA的通用方法一间接免疫荧光试验(IFA)，该方法已得到应用和验证，在此基础上制定本标准SPF鸡微生物学质量控制国家系列标准，包括SPF鸡微生物学监测总则和9种SPF鸡微生物学检测方法。本标准为《SPF鸡间接免疫荧光试验》。SPF鸡微生学检测方法还包括以下部分:GB/T17999.1-1999SPF鸡红细胞凝集抑制试验;GB/T17999.2-1999SPF鸡

2、血清中和试验;GB/T17999.3-1999SPF鸡血清平板凝集试验;GB/T17999.4--1999SPF鸡琼脂扩散试验;GB/T17999.5---1999SPF鸡酶联免疫吸附试验;GB/T17999.6-1999SPF鸡胚敏感试验;GB/T17999.7-1999SPF鸡鸡白痢沙门氏菌检验;GB/T17999.8--1999SPF鸡试管凝集试验。本标准由中华人民共和国农业部、国家科学技术部提出。本标准由农业部畜牧兽医司归口。本标准起草单位:北京市农林科学院畜牧兽医研究所、农业部实验动物研究中心。本标准主要起草人:周文平、赵立红、陈德威。中华人民共和国国家标准GB/

3、r17999.9一1999SPF鸡间接免疫荧光试验SPFchicken-Indirectimmunofluorescentassay1范围本标准规定了间接免疫荧光试验试剂、材料、操作程序及结果判定等本标准适用于SPF鸡感染鸡传染性贫血病毒(ChickenInfectiousAnaemiaVirus,CIAV)后的抗体监测2原理间接免疫荧光试验，以病毒感染细胞作抗原，与待检血清中的特异抗体结合，再与荧光色素标记的抗抗体结合，形成抗原一抗体一抗抗体复合物。荧光色素在紫外光或蓝紫光的作用下，激发出可见的荧光因此出现荧光就说明标记物的存在，同时也反映了特异性抗体的存在。常采用已知抗

4、原及荧光色素标记的抗抗体检测相应的抗体。3试验和器材3.1试剂3门门阴性、阳性血清3.1.2被检血清3.1.3PBS(0.01M,pH7.2)o3.1.4FITC一免抗鸡IgG(按说明稀释使用)。11.5缓冲甘油3.2材料3.2.1湿盒。3.2.2培养箱。3.2.3荧光显微镜。4操作程序车JI感染细胞的制备用MDCC-MSB-1细胞制备鸡传染性贫血病毒感染细胞及未感染细胞(病毒培养技术参见有关文献、车勺L抗原片的制备4.2.1收集培养48h的细胞培养物，1500r/min离心10min，弃上清液，用PBS洗涤细胞沉淀物三次，以少量PBS重悬细胞。4.2.2取10pI细胞悬液

5、(含细胞10'个)，滴加于镀膜印孔载玻片各孔中，同时制备未感染细胞对照片。一一一-一~~一一一一一~~~~~~~一国家质1E技术监督局1999一11一10批准2000一04一01实施GB/T17999.9--19994.2.3滴好的抗原片用热风吹干，冷丙酮(4C)固定10min，保存于一10C，一周内使用。4.3间接荧光抗体染色4.3.1取出抗原片室温放置10min待用4.3.2用PBS将灭活被检血清，阴性、阳性血清分别稀释成I:100,1:500两个稀释度，分别取10pL滴加于抗原片各孔中。4.3.3将加样抗原片置于湿盒内，37C孵育30min,4.3.4用PBS浸洗三次

6、，每次10min,4.3.5取20pLFITC一兔抗鸡工gG滴加于上述处理过的抗原片各孔中，孵育、洗涤同前。4.3.6用缓冲甘油封片，置荧光显微镜下观察5结果判定CIAV感染细胞结构清晰，核内见清晰的荧光颗粒(未感染细胞中无荧光颗粒)，判为阳性。